Cas9表达对酿酒酵母细胞生长和生产天然产物的影响及CRISPR-Cas9编辑系统的优化北大核心CSCD

CRISPR-Cas9基因编辑技术在酿酒酵母中已经得到广泛的应用,但是Cas9作为外源蛋白在酿酒酵母内表达,它对酿酒酵母的生长以及生产天然产物的影响尚不明确。该研究将Cas9基因分别以整合基因组和构建到载体上的形式在酿酒酵母内表达,同时选择2种天然产物类胡萝卜素和次丹参酮二烯为目标产物,研究Cas9表达对酵母生长和生产能力的影响。结果表明,Cas9基因无论整合到基因组表达还是利用载体进行表达,Cas9对酿酒酵母的生长都会产生抑制,并以整合到基因组更为明显。当Cas9基因整合到基因组表达时,对酿酒酵母生产类胡萝卜素和次丹参酮二烯没有影响,但是当Cas9基因利用载体进行表达时,都显著降低了酿酒酵母生产类胡萝卜素和次丹参酮二烯的能力。因此为了进一步能在基因编辑后高效敲除Cas9基因,将Cas9对酿酒酵母的不利影响降到最小。该文系统研究了Ura3载体和Trp1载体的剔除效率,并构建了能够高效进行基因编辑的质粒,优化了CRISPR-Cas9基因编辑系统在酿酒酵母内的应用,为基于Cas9的基因编辑技术的应用提供参考。     

丹参酮生物合成途径中C20位氧化酶改造研究

丹参酮类化合物是丹参主要有效成分之一，在心血管类疾病治疗中发挥重要作用，丹参酮类化合物的微生物异源生产能够为含丹参中药制剂生产提供大量原材料，降低提取成本，缓解临床用药压力。丹参酮生物合成途径包含多个P450酶，高效优势的催化元件是丹参酮微生物生产的基础，该研究以丹参酮途径关键P450-C20位羟化酶CYP76AK1为研究对象，使用SWISS-MODEL、Robetta和AlphaFold2这3种蛋白建模方法，对所得蛋白模型进行分析，获取可靠蛋白结构，以分子对接和同源比对进行突变体蛋白的半理性设计。筛选发现了影响CYP76AK1氧化活性的关键氨基酸位点，通过真核表达对所得突变体进行体外功能研究。研究获得了对11-羟基柳杉酚具有连续氧化功能的CYP76AK1突变体元件，解析了影响其氧化活性的4个关键氨基酸位点，并根据突变结果分析3种蛋白建模方法的可靠性。研究首次报道了丹参中CYP76AK1的有效蛋白改造位点，为丹参酮类化合物合成生物学研究提供了C20位不同氧化活性的催化元件，为解析C20位修饰P450蛋白的连续氧化机制奠定基础。