柴胡-黄芩药对的不同分离部位对H_2O_2刺激肝星状细胞增殖的影响

目的:研究柴胡-黄芩药对的不同分离部位对过氧化氢(H_2O_2)刺激的肝星状细胞增殖的影响,探讨柴胡-黄芩药对抗肝纤维化主要药效物质基础。方法:柴胡-黄芩水提液经D101型大孔吸附树脂吸附,依次用水、30%、60%和90%的乙醇梯度洗脱,分别得到水洗脱部位(A)、30%乙醇洗脱部位(B)、60%乙醇洗脱部位(C)及90%乙醇洗脱部位(D)。体外培养肝星状细胞,采用不同浓度的H_2O_2刺激肝星状细胞增殖,筛选最佳造模浓度,然后用柴胡-黄芩药对水提液及A、B、C、D的高、中、低剂量组进行干预24 h。采用MTT法测定各组肝星状细胞的抑制情况;应用ELISA法检测细胞上清液中透明质酸酶(hy-aluronidase,HA)、层黏连蛋白(laminin,LN)、Ⅲ型前胶原(procollagenⅢ,PCⅢ)、Ⅳ型胶原(collagen typeⅣ,Ⅳ-C)的浓度。结果:结果显示,5μmol/L的H_2O_2能显著刺激肝星状细胞增殖,柴胡-黄芩药对及其各分离部位对H_2O_2刺激的肝星状细胞增殖均具有一定的抑制作用,而且能够将低HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的细胞释放水平,具有剂量相关性,其中B、C高剂量组对其抑制作用最为明显,有统计学意义(P0.01)。结论:柴胡-黄芩药对及其30%、60%乙醇洗脱部位对H_2O_2刺激的肝星状细胞增殖均具有一定的抑制作用,30%、60%乙醇洗脱部位可能是柴胡-黄芩药对抗肝纤维化主要有效部位。     

温热中药对大鼠背根神经节细胞寒、热敏感蛋白TRPM8、TRPV1的作用研究

目的:探讨温热中药黑顺片、干姜、肉桂、仙茅对大鼠背根神经节细胞中寒、热敏感蛋白TRPM8、TRPV1的影响。方法:培养原代大鼠背根神经节细胞,应用温热中药黑顺片、干姜、肉桂、仙茅进行干预,观察各种细胞的增殖情况,并应用RT PCR、Westernblot方法检测各组细胞的TRPM8、TRPV1及PPKA的基因、蛋白的表达。结果:与空白对照组比较,温热药可提高细胞TRPV1及PPKA基因、蛋白表达,可降低TRPM8基因、蛋白表达,温热药对背根神经节细胞TRPV1/TRPM8的增高显著高于空白对照组。结论:温热药可能调控神经的TRPV1和TRPM8表达,TRPV1/TRPM8可能是反映温热药的温热药性的表达指标之一,一定程度上揭示温热中药的药性生物学机制。     

四逆汤及拆方对缺血缺氧大鼠心肌细胞H9C2保护作用的探讨

目的:研究四逆汤及拆方水煎液对体外培养的缺血缺氧大鼠心肌细胞H9C2的保护作用。方法:利用厌氧培养盒构建厌氧环境,以D-Hanks液模拟缺血液,构建H9C2的缺血缺氧模型;将加有D-Hanks稀释过的四逆汤及拆方水煎液的H9C2置于厌氧盒中培养,MTT法测定H9C2的存活率;ELISA法测定细胞培养上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)的含量。结果:四逆汤及拆方加药组(四逆汤加药组、附子+干姜加药组、附子+甘草加药组、甘草+干姜加药组、甘草加药组、附子加药组、干姜加药组)在浓度均为5mg生药/ml时,与模型组比较均能提高H9C2的存活率;其中附子+干姜组(108.2±5.0)、四逆汤全方组(82.3±2.0)、附子组(78.4±10.0)均能明显提高缺血缺氧H9C2的存活率;细胞上清中CK-MB含量与TNF-α含量呈正相关(r=0.866),细胞存活率与TNF-α含量呈负相关(r=-0.0846)。结论:四逆汤及拆方水煎液通过抑制细胞TNF-α的释放,显著减少H9C2的凋亡,提高细胞存活率,对缺血缺氧的H9C2有直接保护作用。     

四逆汤及其拆方水煎液对缺血心肌细胞的保护作用

目的:探讨四逆汤(Sini decoction,SND)及其拆方水煎液对缺血大鼠离体心肌细胞H_9C_2的保护作用。方法:采用不同浓度的含药培养液培养细胞,显微镜下观察心肌细胞建模前后的生长状态;利用MTT比色法比较各加药浓度下单味药、药对、全方对缺血前后心肌细胞H_9C_2存活率的影响,并分析各试药之间作用的差异。结果:1)400倍镜下可见正常培养细胞生长状态良好,细胞形态为梭形,聚集式生长;缺血模型细胞形态改变,间隙变大,结构发生萎缩,死亡细胞增多。2)与缺血后SND组比较,10、20、5 mg/mL浓度干姜水煎液(Ginger water decoction,GWD)对缺血后H_9C_2细胞无保护作用,存活率分别为(44.89±2.59)%、(49.43±1.87)%、(73.67±1.30)%,两两之间差异显著(P0.01)。在浓度为1.0 mg/mL时,附子水煎液(aconite water decoction,AWD)对缺血前后各组细胞均产生细胞毒性。甘草水煎液(Licorice water decoction,LWD)同附子-甘草水煎液(licorice and aconite decoction,LAWD)比较,对H_9C_2保护作用均较弱。附子-干姜水煎液(Ginger and aconite water decoction,GAWD)各浓度缺血后加药组同SND组比较对H_9C_2保护作用无差异。结论:SND及其拆方GAWD、LAWD、AWD、LWD均对缺血H_9C_2有明显促增殖作用;各浓度GWD对缺血H_9C_2无保护作用,1.0 mg/mL AWD有细胞毒性。     

基于热敏感蛋白TRPV1的温热药性表达研究

目的:探讨温热药对虚寒动物的热敏感蛋白(transient receptor potential vanilloid type-1,TRPV1)及体内cAMP(Cyclic Adenosine monophosphate)/PKA(protein kinase A)信号通路影响。方法:建立大鼠虚寒模型,应用温热中药黑顺片(30 g生药/kg)、干姜(20 g生药/kg)、肉桂(10 g生药/kg)及仙茅(30 g生药/kg)进行干预,应用放免法检测血清促甲状腺素(thyroid stimulating hormone,TSH)、甲状腺素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、皮质酮(Corticosterone,COR)、环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP),应用免疫组化法检测大鼠下丘脑、海马、背根神经节中热敏感蛋白(TRPV1)、磷酸化蛋白激酶A(Phospho-(Ser Thr)PKA,PPKA)蛋白表达。结果:虚寒组大鼠出现活动减退、爱扎堆、毛色枯萎等现象,血清中TSH、T3、T4、COR、cAMP、c GMP含量降低,大鼠下丘脑、海马、背根神经节中TRPV1、PPKA蛋白表达明显降低,黑顺片(30 g生药/kg kg)、干姜(20 g生药/kg)、肉桂(10 g生药/kg)及仙茅(30g生药/kg)干预后,大鼠活动性增加,毛色改善,血清中TSH、T3、T4、COR、cAMP、c GMP含量明显升高,大鼠下丘脑、海马、背根神经节中TRPV1、PPKA表达明显增强。结论:热性药可改善虚寒状态内分泌水平,其作用机制可能与增强虚寒机体时下调的TRPV1、PPKA蛋白表达有关,从而表达出温热药性。