蛋白质组学在心血管疾病中的研究进展

蛋白质组学是对组织或细胞中全部蛋白质的表达和功能模式进行研究的新学科.蛋白质组学在心血管疾病领域的研究,促进了对疾病本质认识的深入,提高了临床诊断和治疗水平.现就近年来蛋白质组学在心血管疾病领域的研究进展作简要概述.     

人心房肌KChIP2基因表达质粒pEGFP-KChIP2

目的：KChIPs作为瞬时外向钾通道（Ito）最重要的辅助亚基,在调控通道基因表达和电流特性中起重要作用。本实验拟构建人心房肌KChIP2基因表达质粒,为研究KChIP2对Ito的调控功能奠定基础。方法：①提取人心房肌总RNA,逆转录得到cDNA;②通过特异性引物进行PCR扩增得到KChIP2编码区全长序列,亚克隆到pMD18-T载体中．得到重组克隆质粒pMD18-T—KChIP2;③再设计带有酶切位点HindⅢ和BamH Ⅰ的特异性引物,对重组克隆质粒pMD18-T—KChIP2进行PCR扩增,得到含有酶切位点的KChIP2编码区全长序列;④对含有酶切位点的KChIP2全长片段和pEGFP—c1进行HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切反应,然后进行电泳后胶回收,再进行连接和转化反应;⑤提取质粒,测序鉴定。结果：质粒测序结果与PubMed数据库KchIP2（AY026328）序列比对,同源性为99％。结论：成功构建人心房肌KChIP2基因表达质粒,为下一步转染实验研究KChIP2对瞬时外向钾通道的功能调控奠定了基础。     

人心房肌KChlP2和SK2基因表达检测及方法研究

目的检测人心房肌KChIP2和SK2基因表达,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础。方法提取人心房肌组织总RNA,采用RT-PCR方法获取KChIP2、SK2、GAPDH、β-actin目的片段,与pMD-18Tvector连接成重组质粒,转化到大肠杆菌DH5α中,通过PCR和测序鉴定。提取含目的基因的质粒作为标准品。采用Taqman探针法与SYBR Green I法分别检测人心房肌SK2与KChIP2基因表达和构建标准曲线。结果人心房肌存在KChIP2和SK2基因表达,质粒标准品经过PCR鉴定并测序,与Pubmed数据库完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2〉0.99。结论成功检测人心房肌KChIP2和SK2基因表达,构建的质粒标准品能用于后续实验。     

人心房肌KCh1P2和SK2基因表达检测及方法研究

目的 检测人心房肌KChIP2和SK2基因表达,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础.方法 提取人心房肌组织总RNA,采用RT-PCR方法获取KChIP2、SK2、GAPDH、β-actin目的 片段,与pMD-18T vector连接成重组质粒,转化到大肠杆菌DH5α中,通过PCR和测序鉴定.提取含目的 基因的质粒作为标准品.采用Taqman探针法与SYBR Green Ⅰ法分别检测人心房肌SK2与KChIP2基因表达和构建标准曲线.结果 人心房肌存在KChIP2和SK2基因表达.质粒标准品经过PCR鉴定并测序.与Pubmed数据库完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2>0.99.结论 成功检测人心房肌KChIP2和SK2基因表达,构建的质粒标准品能用于后续实验.     

基于HTRF方法的PGE2释放抑制高通量筛选模型的建立及其在中药活性成分发现中的应用

前列腺素E2(prostaglandins E2,PGE2)是参与炎症、疼痛等多种生理病理机制过程的活性物质。该文在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7产生PGE2的模型上,利用均相时间分辨荧光(homogeneous time-resolved fluorescence,HTRF)方法结合全自动化筛选操作系统,建立检测PGE2含量的高通量模型,选用公司中药物质基础库内的5 121个中药成分为检测样品,用于筛选PGE2抑制剂。该模型选择细胞铺板密度为每孔2 000个细胞;阳性化合物的IC50平均值为(7.3±0.1)μmol;检测板的Z'因子均大于0.5,平均值为0.7;5 121个样品中有228个样品在检测浓度对PEG2产生的抑制率大于50%,23个样品对PEG2产生的抑制作用大于80%。该模型数据稳定性和准确性均达到预期标准,表明筛选结果可靠真实;自动化筛选系统的引入,令该模型具有快速,微量,高效等优势,日平均筛选量达到14 000数据点以上,为抗炎镇痛相关新药发现和中药有效物质成分的前期快速筛选提供了新的模型。     

慢性心房颤动患者心房肌KChIP2基因mRNA水平的定量检测

目的 心房颤动(房颤)是最为常见的快速性心律失常之一.钾通道相关蛋白2(K+channel interacting protein 2,KChIP2)是心肌细胞瞬时外向钾通道的重要辅助亚单位,在,Ito发挥正常功能中起着重要的作用.报告采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术通过对房颤时KChIP2和Kv4.3基因mRNA水平进行定量研究,探讨KChIP2在房颤中的作用和对于瞬时外向钾通道的可能调控机制.方法 (1)30例风湿性心脏病患者分为两组:窦性心律组(窦律组)13例,持续性房颤组(房颤组)17例,取其常规切除的右心耳组织作为研究对象;(2)提取心房肌组织总RNA,通过RT-PCR和TA克隆技术构建含有目的 基因片段的质粒标准品;(3)以GAPDH为内参照基因,采用SYBR Green I法实时荧光定量PCR技术检测持续性房颤和窦律患者KChIP2和Kv4.3基因mRNA水平.结果 (1)标准曲线和熔解曲线:标准曲线线性关系良好,相关系数R2＞0.99.熔解曲线呈明显单峰状,退火温度与预测值基本一致;(2)窦律组和房颤组KChIP2/GAPDH比值分别为0.2200±0.0388、0.1468±0.0452,房颤组KChIP2基因mRNA水平低于窦律组,P＜0.01;窦律组和房颤组Kv4.3/GAPDH比值分别为0.5257±0.1427、0.3946±0.1826,房颤组Kv4.3基因mRNA水平低于窦律组,P＜0.05.结论 与窦律患者相比,房颤患者KChIP2基因和Kv4.3基因明显下调,KChIP2和Kv4.3基因下调是房颤时Ito电流下调的分子基础.     

人心房组织小电导钙激活钾通道的分子鉴定

目的：证实人心房组织有SK2的存在。方法：RT-PCR和western-blot分别检测SK2的mRNA和蛋白。结果：RT-PCR检测到人心房组织中存在SK2的mRNA,western-blot检测到SK2的特异性条带。结论：人心房组织存在SK2。     

慢性心房颤动患者心房肌mink亚单位基因mRNA水平的定量检测

目的：心房颤动是目前最为常见的快速性心律失常之一。mink是心肌细胞延迟整流钾通道（Iks）的重要辅助亚单位,在Iks发挥正常功能中起着重要的作用,同时参与心肌细胞其它离子通道电流的调控。本研究采用实时荧光定量PCR技术通过对房颤时mink基因mRNA水平进行定量研究,探讨mink在房颤中的作用和潜在调控机制。方法：①16例风湿性心脏病（rheumaticheartdisease,RHD）患者分为2组：窦性心律组（SR组）8例、房颤心律组（AF组）8例,取其常规切除的右心耳组织作为研究对象;②提取心房肌组织总RNA,通过RT-PCR和TA克隆技术构建含有目的基因片段的质粒标准品;③以GAPDH为内参照基因,采用SYBRGreenⅠ法实时荧光定量PCR技术检测慢性心房颤动和窦性心律患者mink基因mRNA水平。结果：①标准曲线和熔解曲线：标准曲线线性关系良好,相关系数R2〉0.99。熔解曲线呈明显单峰状,退火温度与预测值基本一致;②SR组和AF组mink/GAPDH比值分别为0.1890±0.0721（n=8）和0.1413±0.0954（n=8）,AF组mink基因mRNA水平低于SR组,P〈0.05。结论：与窦性心律患者相比,心房颤动患者mink基因明显下调,mink基因表达量的改变可能参与房颤重构的分子基础。