丹参Pht1基因家族的挖掘、鉴定及其特征性分析

目的对丹参Salvia miltiorrhiza基因组中存在的Pht1基因家族成员进行挖掘、鉴定和功能预测分析,为进一步研究和利用Pht1这一功能基因家族奠定基础。方法基于丹参基因组数据库及NCBI数据库,借助生物信息学方法,首先筛选获得丹参Pht1家族候选基因的序列,进而对其进行多重序列比对、保守结构查找及系统进化树构建,最后完成其特征性分析和生物学功能预测。结果从丹参基因组中共挖掘出了12个新的Pht1候选基因,加上已报道的Smpht1,共13个Pht1成员,其同源性高达74.34%,并对9个成员提供了比较可靠的功能注释。该家族基因中,Smpht1Sm1、Sm4Sm6、Sm5Sm11这3对成员可能属于彼此协同进化的同功能基因;Smpht1、Sm1、Sm3、Sm5、Sm7及Sm11这6个成员在丹参根部表达,除了受缺磷特异性诱导表达的Sm7和不受磷素供缺因素所影响的Sm3以外,其余4个均有可能属于缺磷诱导增强表达型基因,进而对丹参磷素吸收起着重要作用;另外,Sm7与Sm16还有可能在丹参花器官中表达而参与植株花期磷素平衡的调节;Sm14则很有可能是一个菌根诱导特异性表达的磷转运基因。结论首次系统地从丹参基因组中挖掘筛选出Pht1基因家族,并发现了具有特征性生物学功能的成员,这将为进一步阐明Pht1在丹参生长发育和药效成分代谢中所起作用的相关研究提供背景支持和思路参考。     

丹参SmCPS1基因启动子区甲基化特征分析及其与SmCPS1组织差异性表达的关系

目的:分析不同组织中丹参(Salvia miltiorrhiza)柯巴基焦磷酸合酶1基因(SmCPS1)启动子区甲基化分布特征及其与SmCPS1组织差异性表达的关系。方法:采用重亚硫酸盐转化法检测不同组织中SmCPS1启动子区-1 021 bp(转录起始位点+1)内的甲基化率;实时荧光定量聚合酶链式反应Real-time PCR检测不同组织中SmCPS1表达量。结果:SmCPS1启动子区甲基化主要集中在转录起始位点上游-750~-500 bp,-450 bp以内的启动子区几乎无甲基化。300个甲基化检测位点中,组织差异性甲基化位点共72个,占总检测甲基化位点数的24%;发生甲基化的转录因子结合区域共18个,其中有10个区域的甲基化存在组织差异。与SmCPS1表达量显著相关(P0.01)者21个,其中7个负相关者集中在-632~-450 bp,14个正相关者分布在-632 bp之外及-450 bp以内的启动子区。结论:SmCPS1启动子区甲基化差异可能是影响其组织差异性表达的原因。     

三斑海马蛋白质组学双向电泳技术的建立与优化

目的:建立适于三斑海马干药材蛋白质组研究的双向电泳技术,为后期进行深入的中药材海马蛋白组学研究奠定基础。方法:对影响蛋白质双向电泳的几个关键环节——提取方法、裂解液、纯化方法、上样量进行优化,筛选最佳方法流程。结果:优化出的海马蛋白质提取方法为液氮研磨法,最佳蛋白质提取裂解液为7 mol·L~(-1)尿素,2 mol·L~(-1)硫脲,含4%Chaps,1 mmol·L~(-1)PMSF,65 mmol·L~(-1)DTT和0.2%Bio-Lyte,最佳蛋白质纯化方法为超滤+TCA丙酮沉淀两步纯化法,双向电泳最佳上样量为300μg。Image master 7.0软件对电泳图谱分析共检测出三斑海马蛋白质斑点236个,相对分子质量在14.4~97.4 k Da均有分布,分布差异不明显;蛋白质等电点主要分布在p H 4~9,其中以碱性蛋白质最为丰富。结论:利用上述方法所得的双向电泳图谱斑点清晰、分离均匀,图谱质量佳,该方法流程适合三斑海马药材蛋白质组学分析。该研究能为后期进行深入的海马蛋白质组学研究,筛选特征性蛋白质奠定基础。     

适合果实类中药的DNA条形码鉴定方法研究

目的:探索适合果实类中药的通用DNA条形码鉴定方法。方法:以南五味子、五味子药材为实验材料,筛选最佳DNA提取方法和提取部位,选择ITS2片断进行PCR扩增后测序,所得序列用MEGA 5.10软件分析比对,计算遗传距离(K2P),利用Neighbour-joining tree(NJ树)法和Blast法进行序列比对,构建系统聚类树;并用木瓜等8种常用果实类中药验证方法的可行性和有效性。结果:适合果实类中药的通用DNA条形码鉴定方法是:采用试剂盒法(离心柱型)提取种仁部位DNA,以ITS2片段为DNA条形码序列进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测及测序后,录入"中药材DNA条形码鉴定系统"进行物种鉴定。结论:该方法可有效应用于果实类药材的鉴定。