基于DNA条形码的蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及混伪品等32种的鉴别

目的:利用DNA条形码线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因鉴别蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品共32种蛇类。方法:收集蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品,对样品DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,扩增产物电泳后进行双向测序。应用Codon CodeAligner11.0.1软件对峰图质量进行比对、拼接,利用MEGA11.0软件对各物种碱基进行分析,构建邻接(NJ)系统聚类树并计算遗传距离。结果:NJ系统聚类树显示,蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品共32种均独立聚为一支,眼镜蛇科与蝰科聚为一支,并与游蛇科并列聚类。游蛇科黄环林蛇、颈棱蛇与眼镜蛇科聚为一支,游蛇科赤链华游蛇、环纹华游蛇、草腹链蛇与蝰科聚为一支,锦蛇属玉斑锦蛇、黑眉锦蛇、百花锦蛇未聚为一支。结论:利用DNA条形码COⅠ基因能够准确鉴定蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品共32种蛇类,赤链华游蛇、环纹华游蛇、草腹链蛇、黄环林蛇、颈棱蛇、玉斑锦蛇、百花锦蛇、黑眉锦蛇、宽吻水蛇、铅色水蛇、中国沼蛇、渔游蛇的种属归类有待进一步研究。     

基于ITS2序列多种龙胆属植物及药材的DNA条形码鉴定研究

目的:基于内转录间隔区2(internal transcribed spacer2,ITS2)碱基序列,运用DNA条形码方法对龙胆属多种植物及药材进行鉴别分类研究,为龙胆药材和基原植物的鉴定和遗传多样性研究提供科学的理论依据。方法:利用试剂盒提取法,提取药材及原植物叶片的DNA,对其中特定的ITS2序列进行PCR扩增及测序,并从GenBank下载同科属植物序列,运用Seq Man软件对序列进行拼接去引物处理之后,采用MEGA 6.0软件对数据进行分析比对,计算K2P遗传距离,并建立Neighbor-Joining(NJ)树,结合下载的序列二级结构,进行比对,分析差异。结果:从NJ聚类树可以看出,不同品种的龙胆属植物三花龙胆、深红龙胆、坚龙胆和笔龙胆都各聚为一支,区分明显,龙胆与条叶龙胆聚为一支未能区分开。除去笔龙胆1份样品产生种内变异之外,各同品种样品的ITS2序列均一致相同,并能与外族群品种准确区分开。结论:运用ITS2序列对龙胆药材及基原植物进行鉴别是有效可行且成功率高的一种方法,能对不同品种、近缘品种进行鉴别,有较强的可行性,DNA分子条形码鉴别方法可用于龙胆属不同植物及药材的鉴定分类。     

基于DNA条形码和二级结构鉴定菟丝子及其易混伪品

目的：利用DNA条形码ITS2碱基序列及其二级结构对菟丝子及其混伪品金灯藤进行鉴定。方法：从安徽亳州药材市场收集10份菟丝子、5份南方菟丝子、5份金灯藤样品,提取基因组DNA后,利用ITS2序列扩增引物进行PCR及测序,并从GenBank下载菟丝子、南方菟丝子、金灯藤ITS2序列。利用MEGA 11.0对序列进行比对分析,计算种内、种间遗传距离,利用邻接法（NJ）构建系统聚类树,通过数据库预测ITS2二级结构。结果：菟丝子、南方菟丝子、金灯藤构建的NJ树分别聚为一支,基于ITS2碱基序列的种间遗传距离能准确鉴别菟丝子、南方菟丝子、金灯藤;菟丝子、南方菟丝子、金灯藤的二级结构在整体上有较大区别,能够明显区分。结论：基于ITS2序列可以准确地鉴别菟丝子及其混伪品。     

基于COⅠ基因对东北林蛙、中国林蛙等蛙属24种的鉴定

目的 利用DNA条形码线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因（COⅠ）技术对东北林蛙等24种进行鉴别,构建邻接（NJ）系统发育树,对24种进行系统聚类分析,为东北林蛙等蛙类的鉴别,分类及新种的发现提供一定的依据。方法 收集东北林蛙、中国林蛙、黑龙江林蛙、徂崃林蛙、桓仁林蛙各10只,提取其DNA并进行聚合酶链式反应（PCR）扩增,将扩增成功的序列测序,共测得50条COⅠ基因序列;从GenBank数据库中获得蛙科蛙属24种163条COⅠ基因序列及蛙科侧褶蛙属,臭蛙属,琴蛙属,水蛙属,湍蛙属各一条COⅠ基因序列;利用MEGA X进行序列比对,分析各物种COⅠ基因序列简约性信息位点,计算种内,种间遗传距离,构建NJ树进行系统聚类分析。结果 东北林蛙等24种COⅠ基因序列长度为554 bp,共有210个简约性信息位点,各物种种内遗传距离均<2%;除桑植蛙与明全蛙种间遗传距离为0.004外,其余各物种种间遗传距离范围为0.024~0.228;桑植蛙与明全蛙聚为一支,部分东北林蛙与Rana uenoi聚为一支,中国林蛙有2个独立的分支,其余各物种均独立聚为一支。结论 DNA条形码COⅠ技术能够对东北林蛙等21种进行鉴定及鉴别,支持桑植蛙与明全蛙,韩国林蛙与昆嵛林蛙为同物异名,其中一支中国林蛙可能是蛙科蛙属未下载的4个种之一或新种。这表明DNA条形码COⅠ技术不仅可以鉴定及鉴别东北林蛙等24种蛙类,也可以为蛙科蛙属的分类,新种或亚种的发现提供一定的科学依据。     

丹参品种、产地及栽培历史本草考证

丹参为我国常用大宗中药材,历代本草均有记载,药用历史悠久,功效显著,具有活血止痛、宁心安神的作用,为常用活血化瘀药,临床医疗价值较高,在治疗心肌缺血、改善肝功能、保护肾脏、对抗肿瘤等方面具有较好的效果。查阅文献发现,近年来对丹参的研究大多集中在药理成分、临床等方面,鲜有从古籍文献出发对丹参品种、产地及栽培历史进行研究。通过系统查阅丹参古今文献发现,丹参近缘品种较多,在民间应用和地方入药中同属多种植物的根均作丹参用;在清代以前为野生丹参,清代以后才出现人工栽培丹参,以山东、四川丹参质量最好;各地虽有栽培,但是栽培品种混杂,品质退化严重,质量参差不齐,为此,有必要对丹参的品种、产地及栽培历史进行考证,为丹参正本清源及资源的进一步开发利用提供理论基础和现实依据。     

基于COI序列的哈蟆油基原动物DNA条形码鉴定研究

哈蟆油具有较高的经济和社会价值,其混伪品较多,给市场造成了很大的混乱。利用基于COI序列的DNA条形码技术对已鉴定的东北林蛙、中国林蛙、桓仁林蛙和黑龙江林蛙进行PCR扩增和测序,建立4种林蛙COI基因数据库;将所测的序列与Gen Bank上的序列进行比对,显示为上述4种林蛙;应用MEGA(molecular evolutionary genetics analysis)7.0软件计算K2P遗传距离并构建NJ(neighbor-joining)系统聚类树,所测4种林蛙的序列和Gen Bank上下载的4种林蛙的序列分别聚为1支,但与Gen Bank上下载的2个外群独立分开,东北林蛙的COI基因可能存在地域性差异,但该技术并不能鉴别林蛙的雌雄。结果显示DNA条形码技术能够准确鉴定哈蟆油的基原动物,说明DNA条形码COI为哈蟆油基原动物的鉴定提供一个新的手段和方法。     

动物类中药DNA条形码鉴定研究进展

DNA基因鉴定是近年来应用在中药鉴定中较为重要的分子生物技术,该技术能够很好地从基因层面上鉴别药材,具有较高的准确性。DNA基因鉴定包括DNA分子遗传标记,核酸探针杂交,DNA条形码分子鉴定法等,其中发展最快的为DNA条形码分子鉴定法。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术,是传统形态鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T)4种碱基以不同顺序排列组成,因此对某一特定DNA片段序列进行分析即能够区分不同物种。Hebert等在2003年提出了通过测定线粒体细胞色素C氧化亚基I(COI)基因序列来鉴定动物的种类。陈士林等则在大量实验的基础上提出了鉴别动物的基因以COI基因为主,ITS2基因为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。大量的实验表明,通过DNA条形码来鉴别动物具有准确性、可行性、简便性、通用性,为鉴别动物物种及发现新物种提供了新的方法,为鉴别动物药材的真伪提供了科学的依据。但由于该技术是通过基因进行鉴定,对实验材料及提取方法有较高要求,对一些年代较久的动物药材,其DNA降解较为严重,为DNA提取技术提出了较高的要求;该技术只能鉴别其来源是否准确却不能鉴别其药用部位是否准确,这就需要结合其他鉴别方法来准确鉴别其药用部位。本文通过综合国内外对DNA条形码的研究,为日后的研究和应用提供理论依据。     

基于高通量测序技术对人参花及其易混淆品鉴定研究

目的 利用高通量测序技术对人参花及其易混淆品进行鉴定，并利用ITS2测序技术验证高通量测序技术对物种鉴定的准确性。方法 对人参花掺伪样品扩增产物进行高通量测序，使用cutadapt、PEAR、PRINSEQ、Usearch、RDP classifier、SINTAX软件获得分类单元(operational taxonomic unit，OTU)序列，舍弃菌类、unclassified等非绿色植物序列；为避免假阳性情况发生，删除序列数<100条或碱基数<200 bp的OTU序列。对人参花、西洋参花、三七花的ITS2扩增产物进行测序，利用MEGA 11.0对人参花、西洋参花、三七花的ITS2、OTU、GenBank上下载的碱基序列构建邻接法系统聚类树、遗传距离、种间信息位点及对ITS2、OTU碱基序列分别进行Blast分析来验证高通量测序技术对物种鉴定的准确性。通过构建ITS2及OTU碱基序列二级结构对人参花、西洋参花、三七花进行比对分析，根据物种间二级结构的不同对物种进行鉴定。结果 高通量测序共得到54 653条有效序列，人参花、三七花、西洋参花的序列号分别为OTU1、OTU2、OTU3及对应的有效序列分别为31 325，857，442条。通过对各物种的ITS2及OTU碱基序列进行Blast检索，均支持各个物种。人参花与西洋参花、三七花种间遗传距离分别为0.010，0.033，人参花与西洋参花、三七花分别有2，7个信息位点；邻接法系统聚类树显示各个物种均独立聚为一支，其中人参花与西洋参花聚为一大支与三七花并列。人参花与西洋参花二级结构一致，但与三七花在臂Ⅳ及臂Ⅳ与臂Ⅰ之间有A、B、C 3处不同。结论 基于高通量测序技术能够准确鉴定人参花、西洋参花、三七花，对掺伪样品亦具有较强的鉴别能力，为市售人参花样品鉴定提供一定思路。