银杏二萜内酯葡胺注射液及其银杏二萜内酯成分抗人脐静脉内皮细胞氧糖剥夺损伤的转录组学研究

目的 研究银杏二萜内酯葡胺注射液（Diterpene Ginkgolides Meglumine Injection,DGMI）及其银杏二萜内酯成分抗人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells-T1,HUVEC-T1）氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation,OGD）损伤的潜在作用通路。方法 采用CCK-8法分别测定不同浓度银杏内酯A（ginkgolide A,GA）、银杏内酯B（ginkgolide B,GB）、银杏内酯K（ginkgolide K,GK）和DGMI对HUVEC-T1细胞的毒性,明确药物处理细胞浓度;采用转录组测序技术对溶剂对照组（二甲基亚砜）、模型组（OGD/R 4 h/24 h）及给药组（造模＋不同剂量DGMI、GA、GB、GK处理）的细胞样本分别进行转录组测序;通过生物信息学分析方法,以GEO数据库中缺血性脑卒中患者转录组数据为参考,采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）、差异基因富集等分析方法完成对HUVEC-T1 OGD模型及不同浓度药物抗OGD损伤能力的评价,阐明DGMI及其功效成分的潜在作用机制。结果 GSEA分析显示,临床缺血性脑卒中患者血液转录组数据分析获得的疾病富集通路与本实验细胞模型测序结果获得的富集通路相似度为55.6%;DGMI、GA、GB、GK处理组与模型组相比,显著富集的主要信号通路包括FcεRI、NOD样受体、有丝分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）等。差异基因分析显示,与对照组相比,模型组共筛选出439个差异基因,差异基因的基因本体（gene ontology,GO）分析主要富集在应激反应过程,京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）分析主要富集在磷脂酶D、FcεRI、NOD样受体和血小板活化等信号通路;与模型组相比,给药组差异基因的GO分析主要富集在造血和代谢过程,KEGG分析主要富集在血小板活化、磷脂酶D等信号通路。结论 HUVEC-T1 OGD模型模拟了部分缺血性脑卒中的病理特征;DGMI、GA、GB、GK均具有抗OGD损伤作用,发挥抗OGD损伤作用的关键基因及信号通路主要集中在抗炎、抗凋亡、调控血小板活化等生物学过程,可能通过下调FcεRI、NOD样受体、MAPK和VEGF信号通路,干预血小板活化、磷脂酶D等信号通路发挥作用。     

银杏二萜内酯葡胺注射液对缺血性脑卒中小鼠黑质脑区的调控机制研究

目的 研究银杏二萜内酯葡胺注射液（Diterpene Ginkgolides Meglumine Injection,DGMI）在C57BL/6J小鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型黑质脑区中抗脑缺血再灌注损伤的潜在作用通路。方法 C57BL/6J小鼠按随机数字表分为假手术组、模型组、DGMI（25 mg/kg）组及银杏叶提取物761（Ginkgo biloba extract-761,EGb-761,100 mg/kg）组,构建MCAO模型,通过测定各组小鼠术后24 h的改良版神经功能缺损评分和脑梗死率,评价DGMI相较于EGb-761治疗缺血性脑卒中的疗效。进一步利用Illumina二代测序平台对各组小鼠脑组织黑质样本进行高通量转录组测序,并结合基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）、差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）的基因本体（gene ontology,GO）功能和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析等生物信息学分析方法,评价DGMI抗脑缺血再灌注损伤作用及潜在作用机制。采用qRT-PCR验证转录组测序中关键基因表达。结果 与假手术组比较,模型组改良版神经功能缺损评分和脑梗死率显著升高（P＜0.001）;与模型组比较,DGMI组治疗效果与EGb-761接近,可显著改善改良版神经功能缺损评分和脑梗死率（P＜0.01、0.001）。转录组的数据降维分析显示,模型组与假手术组样本显著分离。GSEA结果显示,模型组与假手术组对比显著富集35条通路,DGMI组相较于模型组可有效逆转7条通路。与假手术组相比,模型组共筛选出88个DEGs,将其与他人发现的大小鼠MCAO模型组共同差异基因比较（15个）,有10个基因相同。模型组GO功能分析主要富集在炎症和细胞趋化等过程,KEGG通路分析主要富集在细胞因子互作、肿瘤坏死因子等信号通路。与模型组相比,DGMI组DEGs的GO功能分析主要富集在神经信号传导过程,KEGG通路分析主要富集在多巴胺能信号通路、神经活性受体配体作用等。qRT-PCR验证与转录组结果基本一致。结论 DGMI可有效抵抗脑缺血再灌注损伤,发挥作用的关键基因及信号通路主要集中于抗炎、调节神经突触等生物学过程,可能通过改善多巴胺能通路治疗损伤。     

金振口服液治疗支气管哮喘的药效作用和分子机制

目的 建立小鼠支气管哮喘模型和人非小细胞肺癌细胞（A549）炎症模型,研究金振口服液（Jinzhen Oral Liquid,JZOL）对支气管哮喘的药效作用和分子机制。方法 将 66只雌性 BALB/c小鼠随机分为对照组和模型组,模型组小鼠采用卵清蛋白（OVA）致敏法建立哮喘模型后,将其分为模型组和 JZOL高、中、低剂量（4.4、2.2、1.1 mg·kg^-1）组和地塞米松组（Dex,2 mg·kg^-1）。全身体积描记系统测定小鼠气道反应Penh值。HE染色观察小鼠肺组织病理学情况。瑞氏-姬姆萨染色检测肺泡灌洗液（BALF）中炎性细胞数量。ELISA检测 BALF中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和血清中免疫球蛋白E（IgE）和免疫球蛋白G1（IgG1）浓度。采用20 ng·mL^-1白细胞介素（IL）-1β诱导A549细胞24 h建立细胞炎症模型,随机分为对照组、模型组以及4个质量浓度JZOL（5.39、2.69、1.35、0.67 mg·mL^-1）处理组。MTS法测定JZOL对A549细胞的药物毒性。采用 RNA-seq技术对 6个实验组进行转录组学分析,筛选差异基因,对其进行 GSEA通路富集分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析和基因本体（GO）注释通路富集分析,通过实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）实验对筛选出的关键基因进行实验验证。结果 体内实验表明,JZOL能够改善小鼠肺组织炎性细胞浸润,降低小鼠气道高反应性Penh值,减少BALF中巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的数量,降低BALF中TNF-α和血清中IgE和IgG1的浓度。体外实验表明,JZOL对 A549细胞的最大无毒浓度为 5.39 mg·mL^-1。基因富集分析结果显示,与对照组相比,模型组共获得 46条炎症模型相关通路,而 JZOL不同浓度处理组对这些通路的逆转比例分别为 34.8% （5.39 mg·mL^-1）、50%（2.69 mg·mL^-1）、32.6%（1.35 mg·mL^-1）和26%（0.67 mg·mL^-1）。差异表达基因（DEG）的KEGG富集分析显示,与对照组相比,模型组共富集到58条通路;与模型组相比,JZOL处理组共富集到32条通路,逆转了IL-17、TNF、核苷酸寡聚化结构域（NOD）样受体信号通路等。对IL-17信号通路中趋化因子配体1（CXCL1）、趋化因子配体2（CXCL2）、脂质运载蛋白2（LCN2）进行qRT-PCR验证,与转录组测序结果一致。结论 JZOL对由OVA诱导的小鼠支气管哮喘模型具有显著的治疗功效,能有效缓解哮喘小鼠的气道高反应性并抑制肺部组织的炎症反应。其抗炎效果是通过调节CXCL1、CXCL2和LCN2这几个关键基因的表达,进而影响IL-17信号通路来实现的。