三七皂甙对造血细胞GATA-1和GATA-2转录调控蛋白的诱导作用

目的　观察三七总皂甙 (PNS)对锌指结构GATA族转录调控蛋白的诱导作用 ,探讨PNS在造血细胞内的信号传递途径。方法　选择恰当浓度的PNS作用于正常人骨髓单个核细胞、HL 6 0、K5 6 2、CHRF 2 88和Meg 0 1细胞 ,2周后提取核蛋白 ,用GATA 1和GATA 2抗体行Western印迹杂交 ,检测GATA 1和GATA 2的表达情况。用3 2 P标记的GATA双链寡核苷酸探针行电泳带移动阻滞试验 (EMSA)和抗体胶移动实验 ,检测GATA DNA复合物及亚型。结果　PNS能够促进人骨髓红系、粒系祖细胞增殖。Western印迹杂交显示PNS诱导K5 6 2、CHRF 2 88和Meg 0 1细胞的GA TA 1和GATA 2蛋白表达量增高 ,分别是未经处理细胞的 1 .5～ 2 .8倍和 2 .0～ 3.1倍 ;EMSA结果表明PNS诱导三株细胞的GATA DNA结合复合物条带密度明显增高 ;HL 6 0细胞在PNS处理前后均未显示GATA活性。抗体胶移动实验证明PNS诱导的GATA DNA复合物的主要成分为GATA 1和GATA 2。免疫沉淀显示PNS诱导的GATA 1和GATA 2蛋白均处于磷酸化的功能激活状态。结论　PNS可通过诱导GATA 1和GATA 2蛋白合成增加 ,与相关基因上游调控区的启动子和 (或 )增强子结合的活性增高 ,而调控与造血细胞增殖、分化相关基因的表达     

Effects of Panax notoginseng saponins on proliferation and differentiation in NIH3T3 cells

Objective:To investigate the effects of Panax notoginseng saponins(PNS)on the proliferation and differentiation in NIH3T3 cells.Methods:NIH3T3 cells were treated by various concentrations of PNS 0,0.05, 0.10,0.20,and 0.40 g/L.The vitality and proliferation potential of cells were detected by 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)assay,the alkaline phosphatase(ALP)activity was measured by p-nitrophenyl phosphate(pNPP)assay,and the mineralization formation ability was tested for the cellular differentiation toward osteoblast,as well as the expression level of phosphorylated extracellular signal-regulated kinasel/2(P-ERK1/2),extracellular signal-regulated kinasel/2(ERK1/2)protein kinase was analyzed by Western blot with total cell lysate of NIH3T3 cells treated by PNS.Results:Both MTT andρNPP assay showed that optical density(OD)values were increased in response to PNS treatment at a dose-dependent pattern. The mineralization formation ability was enhanced in PNS-treated NIH3T3 cells compared with untreated cells. Meanwhile,the expression level of P-ERK1/2 protein kinase was up-regulated in PNS-treated NIH3T3 cells, while,the expression level of ERK1/2 protein kinase revealed no obvious difference with or without PNS treated cells.Conclusion:PNS could pay a role to promote the proliferation and differentiation in NIH3T3 cells by means of up-regulation of P-ERK1/2 protein kinase.     

人细胞色素P450 1A1与谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白及其抗体的制备

采用融合蛋白技术原核表达CYP1A1（第241-381个氨基酸）与谷胱甘肽S-转移酶（GST）的融合蛋白作为抗原,用于制备CYP1A1多克隆抗体. 根据正反重组质粒pGEX/1A1表达的融合蛋白大小不同的原理,直接表达筛选得到正向重组质粒pGEX/1A1. 通过优化表达条件, 提高了目的蛋白的表达水平. 包涵体蛋白经制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离, 获含纯化融合蛋白GST-1A1的PAGE凝胶. 直接用含GST-1A1的凝胶悬液免疫BALB/c小鼠,自腹水中获取CYP1A1多克隆抗体（1A1pAb）. 1A1pAb用切胶纯化的融合蛋白GST-2B6交叉吸收,蛋白A- Sepharose亲和层析柱来纯化. 用切胶纯化的融合蛋白GST-1A1及GST-2B6的免疫印迹反应初步鉴定1A1pAb的特异性. 纯化的1A1pAb对融合蛋白GST-1A1反应特异性较强,但仍对GST-2B6有弱交叉反应. 在实际应用中可根据反应强度来加以区分.     

人细胞色素P450 1A1与谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白及其抗体的制备

采用融合蛋白技术原核表达 CYP1 A1 (第 2 4 1- 381个氨基酸 )与谷胱甘肽 S-转移酶 (GST)的融合蛋白作为抗原 ,用于制备 CYP1 A1多克隆抗体 .根据正反重组质粒 p GEX/ 1 A1表达的融合蛋白大小不同的原理 ,直接表达筛选得到正向重组质粒p GEX/ 1 A1 .通过优化表达条件 ,提高了目的蛋白的表达水平 .包涵体蛋白经制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)分离 ,获含纯化融合蛋白 GST- 1 A1的 PAGE凝胶 .直接用含 GST- 1 A1的凝胶悬液免疫 BALB/ c小鼠 ,自腹水中获取 CYP1 A1多克隆抗体 (1 A1 p Ab) . 1 A1 p Ab用切胶纯化的融合蛋白GST- 2 B6交叉吸收 ,蛋白 A- Sepharose亲和层析柱来纯化 .用切胶纯化的融合蛋白 GST- 1 A1及 GST-2 B6的免疫印迹反应初步鉴定 1 A1 p Ab的特异性 .纯化的 1 A1 p Ab对融合蛋白 GST- 1 A1反应特异性较强 ,但仍对 GST- 2 B6有弱交叉反应 .在实际应用中可根据反应强度来加以区分     

大黄素对HL-60细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨大黄素对人白血病细胞HL-60增殖及凋亡的影响。方法:应用MTT法检测大黄素对HL-60细胞增殖的影响;应用流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳观察和检测细胞凋亡;蛋白印迹法(Western-Blot)检测Bcl-2蛋白表达水平的变化。结果:在5～20mg/L浓度范围内,大黄素对HL-60细胞增殖的抑制作用呈时间剂量依赖性20mg/L作用72h后,抑制率分别达到(19.8±2.7)%,(58.8±4.4)%和(73.8±5.7)%;流式细胞术检测发现:大黄素5、10和20mg/L作用24h后,细胞凋亡率分别为(15.5±3.4)%、(56.0±3.4)%和(71.1±5.0)%,与对照组(1.01±0.06)%有显著性差异(P<0.05);DNA琼脂糖凝胶电泳显示典型的梯形条带。大黄素作用24h后,Bcl-2蛋白的表达水平随药物波度增加呈逐渐下降趋势。结论:大黄素能够抑制HL-60细胞增殖,并诱导其凋亡。Bcl-2基因可能参与了大黄素抑制HL-60细胞增殖和诱导凋亡的过程。     

高白细胞性急性髓系白血病细胞基因表达谱的研究

[目的]综合分析高白细胞性急性髓系白血病不同预后患者祖细胞集落形成及对化疗药物的敏感性以及差异表达的基因。[方法]半固体集落形成法观察不同预后患者骨髓祖细胞集落形成及对化疗药物的敏感性。采用Affymetrix公司人类寡核苷酸表达谱芯片检测患者初诊时骨髓单个核细胞基因表达谱,筛选出差异表达数据。[结果](1)患者骨髓祖细胞集落形成和化疗药物的敏感性与预后密切相关,未缓解者的骨髓祖细胞集落明显高于完全缓解患者,且对化疗药物不敏感。(2)完全缓解患者白血病细胞表达上调2倍以上的基因109条,占0.5%。下调2倍以上的基因134条,占0.6%,其中与预后密切相关的为TRIM16、TM4SF1。CD34和DNMT3B。(3)差异表达的基因按功能分成离子通道运输、细胞周期、细胞骨架运动、细胞凋亡等14类。上调的主要为DNA合成修复、细胞凋亡、细胞周期和应激相关等4类;而下调的主要为蛋白翻译合成、信号传导传递、发育相关和细胞骨架运动等4类。[结论]特定的基因表达模式决定患者预后。     

红细胞生成素受体介导的细胞信息通路

红细胞生成素(Epo)是调节红系晚期祖细胞存活、增殖和分化的主要生长因子。Epo通过结合细胞表面特异的红细胞生成素受体(Epo-R)而发挥功能。Epo可激活多条信息通路,且多条信息通路之间又有信息交谈(crosstalk)。体现了Epo-R介导的信号转导的复杂性和特异性。     

人参皂苷及其三醇对白血病细胞增殖抑制、凋亡和药敏的研究

目的:观察人参总皂苷(GS)及其三醇(GPT)对白血病祖细胞增殖抑制、诱导凋亡及化疗药物的协同作用，寻找GS中抗白血病的有效成分。方法:从人参提取GS，再分离出有效成分GPT；用白血病原代细胞与细胞株进行半固体祖细胞集落培养和液体培养，经GS或GPT处理后，采用MTT试验、流式细胞术、Annexin V试验和DNA片段电泳分析及药敏试验等方法检测。结果:(1)GS对白血病祖细胞的促进和抑制增殖的作用呈剂量依赖性，即小剂量刺激正常和白血病祖细胞增殖，中等剂量仍促进正常集落增加，但抑制白血病集落生长。(2)GS与化疗药高三尖杉酯碱、阿糖胞苷、阿霉素和足叶乙苷具有协同增敏作用，小剂量就能增强化疗药物的杀伤作用1．84—2．23倍，并使部分药敏试验由原先的不敏感转为敏感。(3)50mg/L的GS使化疗药物对K562／VCR、K562/／Adr两耐药细胞株的抑制作用明显，且随着GS浓度的升高而逐渐增强。(4)50mg/L的GS作用于HL-60细胞3d能够诱导其凋亡，Annexin V阳性细胞率明显增高，并出现典型的DNA梯形条带。(5)GPT 20mg/L低浓度能够显著地刺激K562细胞增殖，中浓度50mg／L时则抑制细胞增殖。GPT分别与化疗药物高三尖杉酯碱、阿糖胞苷联合应用时，对K562细胞的抑制作用明显增强。结论：不同剂量的GS及GPT对白血病祖细胞具有刺激增殖与抑制生长的双向效应，即小剂量时通过刺激增殖而增强化疗药物的杀伤作用，中等剂量则诱导白血病细胞凋亡。提示GPT是人参皂苷内抗白血病的有效成分，可为临床用作白血病的辅助治疗提供依据。