MicroRNA-34a调控细胞衰老的研究

目的 探讨微RNA-34a(miRNA-34a)对细胞通过调控沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)的表达,从而引起细胞衰老的作用。 方法 构建pre-miRNA-34a表达载体,并将其和一个不针对任何基因的微小RNA-1792(miRNA-1792)表达载体(其他实验室赠送)分别转染至HEK293和HUVEC细胞内,用RT-PCR、Western blot检测各细胞组SIRT1 mRNA与蛋白表达水平,以未转染的细胞为对照;将HUVEC细胞分为转染不同质粒、未转染质粒和用SIRT1激活剂白藜芦醇(终浓度1 μmol/L,作用2 h)处理HUVEC细胞(HUVEC-Res)组,中性彗星电泳分析H₂O₂作用2 h 后4组HUVEC细胞的双链损伤情况;用阿霉素处理上述4组HUVEC细胞2 h,β-半乳糖甘酶(SA-β-gal)染色检测各细胞不同时间点的衰老情况。 结果 测序结果表明pre-miRNA-34a表达载体构建成功;RT-PCR、Western blot显示HEK293-pre-miRNA-34a和HUVEC-pre-miRNA-34a中SIRT1 mRNA和蛋白质表达的水平明显下降(P<0.001);中性彗星电泳检测发现经H₂O₂处理后,HUVEC-Res组DNA损伤最轻,而HUVEC-miRNA-34a组DNA损伤程度最为严重;SA-β-gal染色显示DNA损伤后HUVEC-miRNA-34a衰老程度较其它3组严重,而HUVEC-Res组的衰老程度最为轻微。 结论 miRNA-34a 通过抑制SIRT1表达调控细胞衰老。     

人乳头瘤病毒L2 蛋白的病毒样颗粒疫苗研究

目的:构建乙肝病毒核心抗原(HBcAg)与人乳头瘤病毒(HPV)L2抗原的融合蛋白,在大肠杆菌中重组表达形成病毒样颗粒结构;通过小鼠模型检测HBc-L2融合蛋白的免疫原性,并研究免疫后获得的小鼠血清对HPV假病毒的中和效力。方法:通过DNA合成构建16型人乳头瘤病毒L2基因片段与HBcAg基因的融合基因,将其克隆至表达载体p ET9a并在大肠杆菌中进行HBc-L2融合蛋白表达;将经纯化、鉴定后的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA方法检测小鼠血清中针对L2抗原的抗体效价,并分别研究小鼠血清对16型和18型HPV假病毒的中和效力。结果:HBc-L2融合基因经大肠杆菌系统表达形成可溶性蛋白,经硫酸铵沉淀和CL-4B凝胶分离纯化后获得纯度80%的HBc-L2蛋白;分子筛高效液相色谱-多角度激光光散射(SEC-MALS)联用技术和透射电子显微镜的分析结果表明,HBc-L2融合蛋白在表达过程中自动组装形成稳定的病毒样颗粒;将纯化后的HBc-L2蛋白免疫BALB/c小鼠可获得针对L2抗原的高滴度抗体,且小鼠血清具有中和16和18型两种假病毒的中和抗体活性。结论:HBc-L2病毒样颗粒可以有效地增强L2抗原的免疫原性,并可刺激机体产生针对多型HPV的免疫保护力,是一个具有潜力的新型广谱HPV疫苗。     

洋葱中黄酮类提取物对血脑屏障透过及神经保护作用研究

目的研究采用乙醇回流法从洋葱中提取的黄酮类物质对血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）透过作用以及对原代培养的鼠神经元细胞增殖和凋亡的影响。方法首先原代培养成功SD鼠脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells,BMVECs）;然后原代共培养鼠BMVECs和星形胶质细胞（astro-cytes,ACs）以建立BBB体外模型。采用乙醇回流法从洋葱中提取黄酮类物质,通过透射电子显微镜观察和跨膜电阻值测量验证BBB模型;采用高效液相色谱（HPLC）检测黄酮类提取物对BBB的透过率。采用过氧化氢（H2O2）和黄酮提取物处理神经元细胞,MTT法观察其对细胞增殖和凋亡的影响;彗星电泳和免疫荧光法分析神经元细胞DNA损伤情况。结果透射电镜及跨膜电阻仪鉴定BBB体外模型构建成功;HPLC检测洋葱中黄酮类提取物BBB透过率为60.58%;该提取物在10～20μg/mL浓度对H2O2诱导的鼠神经元细胞凋亡有明显的抑制作用,并可减少神经元DNA损伤。结论采用乙醇回流法从洋葱中提取的黄酮类物质可有效透过BBB,并对H2O2诱导的鼠神经元细胞的凋亡和DNA损伤有明显抑制作用。