白香丹胶囊及白芍提取物对过表达5-HTR2C诱导的海马神经元中PKC的影响

目的:根据前期对愤怒模型大鼠基因芯片研究,构建大鼠5-HTR2C过表达海马神经元,研究白香丹胶囊及君药白芍提取物对5-HTR2C及PKCα/β2的影响,为阐明白香丹胶囊调整愤怒情绪的作用机制提供科学依据。方法:采用基因工程技术,构建5-HTR2C真核表达载体,应用电转染技术,使5-HTR2C在大鼠原代神经元中过量表达,建立5-HTR2C体外高表达的细胞模型,结合中药血清药理学,制备白香丹胶囊和白芍提取物的含药血清,以氟西汀为阳性对照药,干预转染后的神经元,提取各组蛋白后,Western-blot技术检测5-HTR2C及PKCα/β2中相应基因的蛋白表达。结果:与正常组相比,5-HTR2C转染组中5-HTR2C的蛋白表达显著升高(P 0. 001),PKCα的蛋白表达显著下降(P 0. 001),P-PKCα的蛋白表达显著升高(P 0. 001),PKCβ2的蛋白表达显著下降(P 0. 001),P-PKCβ2的蛋白表达显著升高(P 0. 001);与5-HTR2C过表达组相比,白香丹、白芍提取物及氟西汀干预组中5-HTR2C的蛋白表达均显著下调(P 0. 01,P 0. 01,P 0. 05),PKCα的蛋白表达均显著上调(P 0. 05,P 0. 01,P 0. 01),P-PKCα的蛋白表达显著下降(P 0. 001,P 0. 01,P 0. 05),PKCβ2的蛋白表达均显著上调(P 0. 001,P 0. 01,P 0. 05),PPKCβ2的蛋白表达显著下降(P 0. 001,P 0. 001,P 0. 01)。结论:白香丹胶囊能够调整5-HTR2C高表达引起的PKCα/β2及其磷酸化水平的异常变化,且作用比氟西汀稍强,充分显示了整体调节的优势。但是,作为其中主要组分的白芍提取物无显著的调节作用,推测白香丹胶囊其他组分-香附酮及丹皮酚在愤怒致病治疗中也有一定的作用,需进一步研究。     

舒郁胶囊对PMDD肝气郁证模型大鼠Cav1.2介导的CaM/CaMKⅡ信号通路的影响

目的:观察舒郁胶囊对强迫游泳应激诱导的经前烦躁障碍(premenstrual dysphoric disorder,PMDD)肝气郁证大鼠的影响,探讨L型钙通道(L-type calcium channel,LTCC)Cav1.2亚型介导的钙调蛋白(CaM)/CaMKⅡ信号通路在PMDD肝气郁证发生中的机制。方法:动情周期规律的大鼠进行3次强迫游泳实验,筛选出48只雌性Wistar大鼠进入实验,两次非接受期和接受期悬浮不动时间差值绝对值平均值最小的12只为正常组,其余36只分为模型组、舒郁胶囊组(0.408 g·kg-1·d-1),氟西汀组(2.7 mg·kg-1·d-1)。给药组连续给药2个动情周期,模型组和正常组给以等量纯水。采用旷场实验、强迫游泳悬浮不动时间及悬浮不动次数评价模型和药物干预效果。免疫荧光、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测各组大鼠海马脑区中L型钙通道α1C亚型(CACNA1C),CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的分布及表达。结果:CACNA1C蛋白主要分布在细胞膜上,CaMKⅡ蛋白主要分布在的细胞质内;与正常组比较,模型组大鼠体质量、旷场总路程显著下降(P0.05,P0.01),强迫游泳悬浮不动时间、悬浮不动次数显著升高(P0.05,P0.01),海马脑区细胞排列散乱,CACNA1C和CaMKⅡ表达升高(P0.05,P0.01);与模型组比较,氟西汀和舒郁胶囊组大鼠体质量、旷场总路程明显升高(P0.05,P0.01),强迫游泳悬浮不动时间、悬浮不动次数明显降低(P0.05,P0.01),海马脑区细胞排列整齐,CACNA1C和CaMKⅡ表达明显降低(P0.05,P0.01)。结论:利用强迫游泳可成功诱导出PMDD肝气郁证大鼠模型。舒郁胶囊可能通过Cav1.2介导的CaM/CaMKⅡ信号通路发挥治疗作用,显著改善PMDD肝气郁证大鼠的行为学变化。     

Sestrin 2(SESN2)通过激活蛋白激酶B促进肝癌细胞索拉非尼原发性抵抗

目的探讨sestrin 2(SESN2)在肝癌细胞索拉非尼原发性抵抗中的作用和机制。方法实时定量PCR和Western blot法检测Bel-7404、SNU-398、HLE、HLF、Hep3B肝癌细胞系中SESN2 mRNA和蛋白水平,免疫组织化学染色检测肝癌组织中SESN2的表达。分别用(0、2、5、10、15、20、25)μmol/L索拉非尼处理上述肝癌细胞24 h,采用CCK-8法检测肝癌细胞增殖活性并计算索拉非尼半数抑制浓度(IC50),(0、2、4、6、8)μmol/L索拉非尼刺激Bel-7404、SNU-398肝癌细胞24 h,检测癌细胞SESN2 mRNA和蛋白水平;采用SESN2的特异性小干涉RNA(si SESN2)敲低Bel-7404、SNU-398肝癌细胞的SESN2水平,再分别用(0、8)μmol/L索拉非尼刺激24 h,CCK-8法检测细胞增殖活性、流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)水平。结果与正常肝细胞和癌旁肝组织相比,肝癌细胞系和肝癌组织中SESN2水平升高,且癌细胞中SESN2水平与索拉非尼IC50呈正相关;索拉非尼刺激Bel-7404、SNU-398肝癌细胞后,癌细胞SESN2水平升高,AKT信号活化;敲低Bel-7404、SNU-398肝癌细胞的SESN2水平,可进一步抑制细胞增殖活性、促进细胞凋亡、抑制AKT磷酸化。结论 SESN2可通过激活AKT信号促进肝癌细胞索拉非尼原发性抵抗。