胚胎干细胞源性肝干细胞在治疗性肝再生中的应用

目的： 应用治疗性肝再生模型进行胚胎干细胞(ESC)源性肝干细胞肝内移植, 观察其在肝组织替代、体内的生长分化及成瘤性等情况，为ESC移植在难治性肝病治疗中的临床应用提供实验依据。方法： 倒千里光碱+70%肝部分切除建立BALB/c小鼠的治疗性肝再生模型。用荧光示踪剂CFDA SE 标记移植细胞，将经淤胆血清“病理微环境”筛选体系筛选出的ESC源性肝干细胞经门静脉移植入治疗性肝再生模型小鼠肝内。然后荧光显微镜下观察，检测移植细胞体内分布、整合与肝细胞替代、体内生长分化等情况。2周后行白蛋白荧光免疫组化(双荧光染色)、血清白蛋白水平检测其功能状况。并通过观察其体内成瘤性对筛选出的ESC源性肝干细胞的安全性进行评估。结果： CFDA SE标记的ESC源性肝干细胞肝内移植1周，受体小鼠肝实质内可见散在绿色荧光分布。2周后，肝实质内绿色荧光分布区域明显扩大，且可见类似肝索样结构排列。共焦白蛋白荧光免疫组化(双荧光染色)结果表明，受体小鼠肝组织内可见标记细胞表达白蛋白阳性信号（呈黄色荧光），血清白蛋白水平则无明显差异（P>0.05）。6周内未见畸胎瘤形成，而将未分化的ESC移植入小鼠腋区皮下6周后则可见畸胎瘤形成。结论： 经淤胆血清“病理微环境”筛选体系筛选出的ESC源性肝干细胞移植入治疗性肝再生模型小鼠肝内后可有效整合入宿主肝板、在肝内能进一步生长分化并部分表达肝细胞功能。其安全性较好，6周内未见畸胎瘤形成。     

淤胆血清“病理微环境”诱导胚胎干细胞向肝细胞分化

目的:探讨淤胆血清"病理微环境"培养体系诱导胚胎干细胞(ESC)向肝细胞分化的可行性。方法:将小鼠ESC细胞系E14在无白血病抑制因子培养基中培养,使其自发分化为拟胚体,加入FGF-4和HGF初步诱导,然后置于5％淤胆鼠血清"病理微环境"筛选培养液中继续培养2周,然后进行细胞形态学观察,白蛋白和CK8/18免疫组化染色,白蛋白与转甲状腺蛋白RT-PCR检测,细胞糖原染色及尿素合成功能分析。结果: 经初步诱导分化的ESC置于5％淤胆血清"病理微环境"筛选培养液中培养,初期细胞生长受抑制,2周后分化为肝细胞样细胞,细胞呈现良好的均质性;免疫组化染色显示白蛋白和CK8/18表达;RT-PCR显示有白蛋白、转甲状腺蛋白等的mRNA转录;细胞有糖原和尿素合成功能。结论:采用含淤胆血清的病理微环境培养体系从经FGF-4和HGF初步诱导的胚胎干细胞中有效筛选出了具有功能的肝细胞,细胞有较好的均质性,为临床肝细胞替代治疗、获取丰富供体细胞来源提供了新思路。     

猪肝内顺铂还原铁粉混悬液增强体外微波热效应

目的 检测微波治疗仪辐射猪肝内顺铂还原铁粉混悬液的热反应和顺铂组织含量.方法 将顺铂含量为9.52 g/L,铁颗粒含量为95.53 g/L的混悬液1.0ml注射入小家猪肝脏内,用医用微波治疗仪对该注射点进行局部微波加热.用红外热像仪测定加热10、20 min时的温度和发热体最大直径,用高效液相色谱仪(HPLC)检测加热20 min、24h顺铂组织含量.将注射同等剂量顺铂者作为对照.结果 采用微波治疗仪辐射猪肝脏内顺铂还原铁粉混悬液10～20 min,低能级组(30 W)、高能级组(60 W)和对照组(60 W)局部温度分别可以达到43～ 46、45 ～ 52和39～40℃;大于45℃发热体最大直径分别为(2.28 ±0.29)、(2.89±0.32) cm和无;顺铂组织含量分别为(2.16 ±0.17)、(2.15 ±0.13)和(2.22 ±0.35) g/L,24 h以后分别为(1.52 ±0.10)、(1.67 ±0.16)和(0.61±0.14) g/L(P＜0.01).结论 医用微波治疗仪体外辐射可以在10～20 min内将含有还原铁粉顺铂混悬液的肝组织快速升温至42 ～ 52℃,且局部具有较高的抗癌药物组织含量,发热体直径明显大于对照组.     

siRNA沉默肝癌细胞报告基因瞬时表达效应的定量分析

目的研究小分子干扰RNA(siRNA)特异性抑制肝癌细胞基因瞬时表达的可行性和基因沉默效率。方法凝胶电泳成像观察siRNA体外孵育后的降解性,利用Cy3示踪观察其转染HepG2细胞后动力学变化。将报告基因(GFP)和siRNA共同瞬时转染至HepG2细胞,流式细胞仪、Western blot RT-PCR等分析特异性siRNA抑制报告基因瞬时表达的效应。结果siRNA在空白培养液中和转染细胞内可较长时间保持相对稳定。与空白和非特异siRNA相比,GFPsiR-NA明显抑制GFP蛋白产物和mRNA的表达(P<0·05)。结论特异性siRNA能高效沉默人肝癌细胞转染基因的瞬时表达,为基因治疗提供了一种新的治疗策略。     

胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植对宿主肝功能的影响及安全性评估**☆

背景：体外诱导胚胎干细胞分化为肝细胞已有不少成功的报道，但其体内移植后能否有效整合入宿主肝板、在肝内能否进一步生长分化并表达肝细胞功能以及成瘤的风险等情况目前还不清楚。 目的：应用治疗性肝再生模型进行胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植, 观察其在肝组织替代、体内的生长分化及成瘤性情况。 设计：随机对照动物实验。 单位：中山大学附属第二医院小儿外科。 材料：选用BALB/c小鼠24只为受体，鼠龄6~8周，体质量20~ 35 g，雌雄不拘购自广州市实验动物中心。实验所用胚胎干细胞源性肝干细胞由作者所在课题组诱导胚胎干细胞分化而成。小鼠胚胎干细胞株E14由本院干细胞中心提供。 方法：实验于2006-07/2007-06在中山大学附属第二医院干细胞研究中心完成。将24只小鼠随机分为2组：肝再生模型+干细胞移植组和肝切除+干细胞移植组，每组12只。前组分两次按50 mg/kg剂量腹腔内注射倒千里光碱(retrorsine) ，间隔2周，第2次注射4周后行70%肝部分切除制造肝损伤；然后经门静脉分别移植1×105羟基荧光素乙酰乙酸（CFDA-SE）荧光标记的细胞入小鼠肝内进行胚胎干细胞源性肝干细胞移植。后组在行70%肝部分切除制造肝损伤模型后进行胚胎干细胞源性肝干细胞移植。 主要观察指标：荧光显微镜下观察移植细胞组受体鼠肝脏内分布、整合与体内生长分化情况。2周后行白蛋白荧光免疫组化(双荧光染色)、血清白蛋白水平检测其功能状况。将胚胎干细胞源性肝干细胞注入治疗性肝再生小鼠肝内，将未分化的胚胎干细胞移植入小鼠腋区皮下作为对照，观察胚胎干细胞源性肝干细胞体内成瘤情况。 结果：①肝干细胞在受体鼠肝内生长情况：CFDA SE标记的胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植1周，受体小鼠肝实质内可见散在绿色荧光分布。2周后，肝实质内绿色荧光分布区域明显扩大，且可见类似肝索样结构排列。②肝功能：共焦白蛋白荧光免疫组化(双荧光染色)结果表明，受体小鼠肝组织内可见标记细胞表达白蛋白阳性信号（呈黄色荧光），肝再生模型+干细胞移植组和肝切除+干细胞移植组血清白蛋白水平则无明显差异（P > 0.05）。③肝干细胞移植安全性：6周内未见畸胎瘤形成，而将未分化的胚胎干细胞移植入小鼠腋区皮下6周后则可见畸胎瘤形成。 结论：胚胎干细胞源性肝干细胞移植入治疗性肝再生模型小鼠肝内后可有效在肝内能进一步生长分化并部分表达肝细胞功能；且此移植安全性较好。     

阑尾手术扩大回盲部切除44例临床分析

目的：探讨阑尾手术扩大回盲部切除术的指征,为临床外科提供治疗经验。方法：回顾性研究1999—2008年在不同情况下1期施行的阑尾疾病扩大性回盲部切除术共44例,对其术中情况、手术方法、病理类型、疗效进行分析,与同期手术治疗的78例复杂性阑尾切除术进行比较。结果：44例1期施行的回盲部切除术患者均在术后2周内痊愈出院,手术并发症发生率为6．81％。而对照组因肠梗阻、腹腔残余脓肿、肠瘘、回盲部或阑尾肿块而行2次手术者达18例,并发症发生率为23．08％,明显高于回盲部切除术组（P〈0．01）。结论：阑尾疾病合并小肠梗阻、盲肠壁裂口、阑尾或回盲部性质不明肿块等是施行回盲部切除术的主要指征,可明显减少术后并发症。     

恙虫病延误诊治1例报告

1病例患者，男，22岁。因发热，伴头部钝痛、腰痛及四肢肌肉酸痛9天入院。患者9天前元明显诱因出现畏寒、发热，体温最高达40℃，伴头部钝痛、腰痛及四肢肌肉酸痛、食欲下降，无恶心呕吐。在卫生所诊断为“上呼吸道感染”，给予“青霉素钠”等药物治疗，病情无改善。体温每日波动于38．5℃-40℃之间，并出现咳嗽、咳黄色粘液样痰。故转入我院进一步治疗，以“发热待查”收住院。[第一段]     

门静脉高压的外科治疗进展

1引言临床上具有食管胃底静脉曲张、脾肿大脾功能亢进及腹水等门静脉高压三联征者称之谓门静脉高压。其中90%以上继发于肝硬化,我国主要是肝炎后肝硬化和血吸虫病肝硬化。其发病机制除了传统的机械梗阻学说外,对化学递质、免疫异常和分子生物学等方面的研究也有较大的进展,成为门静脉高压“个性化”治疗的理论基础。2分型肝硬化所致门静脉高压属肝内梗阻型,分为窦前型(血吸虫病肝硬化)、窦后型(肝炎后肝硬化、乙醇性肝硬化)。还有少见的先天性肝纤维化、肝豆状核变性(Wilson's病)等。3临床表现和诊断门静脉高压表现为脾肿大脾功能亢进、门…     

HLA-E siRNA沉默肝癌细胞HLA-E基因的表达

目的针对HLA-EmRNA靶序列不同位点,设计合成多个siRNA链,定量分析其对HLA-E(+)肝癌BEL-7402细胞的基因沉默效率,筛选最佳抑制效果的siRNA。方法用IFN-γ(5×105IU·L-1)诱导BEL-7402细胞表达HLA-E基因,经流式细胞技术纯化后作为靶细胞。设计并合成3条HLA-E siRNA链(A、B、C),将各siRNA(0.1mmol·L-1)经脂质体Lipofectamin 2000转染至靶细胞。采用细胞免疫荧光、流式细胞技术、Western杂交、实时PCR等定量方法,比较48h后各siRNA的基因沉默效果,并观察HLA-E基因沉默对NK肿瘤细胞杀伤的影响。结果与空白对照、非特异组相比,3组(A、B、C组)HLA-E siRNA均明显抑制细胞HLA-E抗原、蛋白产物、mRNA、细胞表面HLA-E分子的表达(P<0.01),B、C组抑制效果接近90%,高于A组(P<0.01)。A、B、C组NK肿瘤杀伤率升高(P<0.01),而B、C组肿瘤杀伤效果高于A组(P<0.01)。结论经筛选的HLA-EsiRNA能特异、高效沉默肝癌细胞HLA-E基因表达,可能抑制其非经典HLA-Ⅰ途径免疫逃避,为肝癌"基因-免疫"治疗提供新的治疗策略。     

胃肠术后早期肠内营养治疗246例报告

目的 总结胃肠术后早期肠内营养治疗的临床实施方案及效果。方法 回顾分析1997年1月至2000年12月间胃肠手术后以早期肠内营养进行营养支持治疗的246例的适应证、方式方法及临床效果。结果 246例均取得良好的临床营养支持效果。术后恢复肛门排气时间平均为36h,恢复排便时间平均为48h。整个疗程中病人无饥饿感,术后无明显的体重丢失。未见需终止治疗的并发症。治疗费用约为肠外营养的1／3。结论 早期肠内营养治疗具有符合生理、安全、简便、并发症少、减少医药费用等优点,可例入术后常规应用。