表证模型研究概况与展望

针对目前中医证候模型研究的整体不足和进展缓慢,立足本课题组对表证方证的几十年研究经验基础上,结合现代科学技术最新进展,综合梳理表证模型相关研究,拟在新型表证模型的建立方面寻找新的切入点。通过检索知网、Pubmed等数据库查阅有关表证模型(或上呼吸道感染)的相关文献,按照造模方法进行了较为详细的阐述、分析和总结,展现进展、不足和可能突破口;近年来表证模型在造模方法、方剂反证、方剂研究、生化表征等方面均取得了长足发展,但也存在与临床联系不紧密、方证对应不理想、成模指标不一致、表证评定标准模糊等诸多不足;提出表证病理模型研究应突破原有的思想羁绊,大胆借鉴现代生命科学进展,努力建立多层次的、更加精细的表证病理模型体系。紧密结合临床加强模型研究,充分吸纳生命科学以及其他学科进展,建立多层次更精细的表证病理模型研究系统是目前亟待解决的核心命题,这关乎表证理论、解表方药及其临床实践的深入研究,也是面对日益严重的疫情下人民健康的迫切需求,同时也可为其他证候模型的研究提供借鉴和参考。     

桂枝汤含药血清对不同比例Poly(I:C)-LPS组合刺激肺巨噬细胞的干预效应

目的:基于方证相应原理,旨在探索建立一种模拟病毒-细菌共感染的桂枝汤汤证体外细胞模型,为进一步桂枝汤汤证动物模型的建立积累数据。方法:研究桂枝汤含药血清对不同浓度比例的聚肌胞苷酸[polyinosinic polycytidylic acid,Poly(I∶C)]与脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)混合物刺激的大鼠肺的巨噬细胞(NR8383)Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)及其下游信号转导通路的影响。采用大鼠肺巨噬细胞株NR8383,分别用25,50,100 mg·L-1的Poly(I∶C)与1,5,10 mg·L-1LPS刺激NR8383细胞,前者于3,6,12,24 h后取细胞上清,后者于6,12,24,48 h后取细胞培养上清液,酶联免疫吸附测定方法(ELISA)测定炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-1β(IL-1β)的含量,通过上述2个指标选择Poly(I∶C)与LPS合适的浓度区间与反应的最适时间。利用其Poly与LPS配比为10∶1,20∶1,30∶1,40∶1,50∶1来探讨其对NR8383细胞的TNF-α,IL-1β的含量和TLR-2,3,4,6 mRNA表达的影响,以及桂枝汤含药血清的干预作用,通过上述TNF-α,IL-1β,TLR-2,TLR-3,TLR-4,TLR-6 6个指标对实验结果进行综合评价,筛选刺激效应和桂枝汤干预效应最为明显的Poly(I∶C)-LPS比例。结果:选择刺激时间为6 h,Poly(I∶C)在50 mg·L-1以下,LPS在1 mg·L-1时作为合适的刺激浓度。在所用Poly(I∶C)-LPS(10∶1,20∶1,30∶1,40∶1,50∶1)中,与正常组比较,Poly(I∶C)-LPS 50∶1组合刺激效应显著(P0.01),与相对应的模型组比较,桂枝汤含药血清对Poly(I∶C)-LPS 10∶1组合干预效果最为显著(P0.01)。结论:Poly(I∶C)-LPS 10∶1刺激NR8383巨噬细胞株NR8383可以作为一种桂枝汤汤证细胞模型,用于桂枝汤及其类方的基础研究。     

桂枝汤挥发油的成分归属分析及其对认知障碍小鼠学习记忆的影响

目的 探讨桂枝汤挥发油成分归属及其对认知障碍模型小鼠学习记忆的影响.方法 采用水蒸气蒸馏法分别提取生姜、桂枝及桂枝汤挥发油,采用气相色谱-质谱联用法分析挥发油成分.小鼠按体重分层随机分为正常组、模型组、多奈哌齐组、桂枝汤挥发油低剂量组、桂枝汤挥发油高剂量组.多奈哌齐组灌胃2 mg/kg多奈哌齐溶液,桂枝汤挥发油低、高剂量组灌胃桂枝汤挥发油溶液5、20 mg/kg,药品均以0.5%的羧甲基纤维素钠悬浮至所需浓度,正常组与模型组灌胃等体积0.5%的羧甲基纤维素钠溶液,1次/d,连续给药15 d.除正常组外,其余各组小鼠于给药第8天腹腔注射东莨菪碱1 mg/kg制备小鼠记忆障碍模型.采用Morris水迷宫、跳台法检测学习记忆行为学,ELISA法测定小鼠血清中胆碱酯酶(cholinesterase,chE)、乙酰胆碱酯酶(acetyl cholinesterase,AchE)、丁酰胆碱酯酶(butyryl cholinesterase,BchE)、乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)含量.结果 从桂枝汤挥发油中共鉴定38个化合物,来源于桂枝的9个成分加权占比约44%,来源于生姜的13个成分约占全方挥发油的18%.与模型组比较,桂枝汤挥发油低剂量组在目标象限游泳距离比例[(26.74±16.42)%比(9.42±8.50)%]、目标象限滞留时间的比例[(43.51±25.12)%比(14.50±12.23)%]增加(P<0.05),穿台次数[(1.63±1.19)比(0.25±0.46)]明显增加(P<0.05),跳台试验中犯错误次数[(0.57±0.98)比(4.43±2.40)]降低(P<0.05);桂枝汤挥发油低、高剂量组小鼠血清chE[(140.90±3.27)U/ml、(144.79±6.71)U/ml比(134.49±3.36)U/ml]、AchE[(3.30±1.31)U/ml、(3.94±0.78)U/ml比(8.52±3.39)U/ml]、BchE[(3.22±0.45)U/ml、(3.66±0.53)U/ml比(7.99±0.79)U/ml]水平降低(P<0.05),Ach[(4.10±0.38)ng/ml、(3.03±0.25)ng/ml比(1.72±0.50)ng/ml]水平升高(P<0.05).结论 桂枝汤挥发油主要来源于桂枝和生姜,该部位可通过拟胆碱效应改善东莨菪碱所致小鼠学习认知障碍.     

3种桂枝汤苯丙烯类化合物对ox-LDL诱导人脑微血管内皮细胞氧化应激损伤的保护作用

该研究主要探讨3种桂枝汤苯丙烯类化合物(桂皮醇、桂皮醛和桂皮酸)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脑微血管内皮细胞(HBMEC)氧化应激损伤的保护作用。实验通过MTT活力试验确定3种桂枝汤苯丙烯类化合物和ox-LDL对HBMEC的增殖和损伤浓度,将处于对数生长期HBMEC分为空白对照组(DMSO)、模型对照组(ox-LDL)、叔丁基对苯二酚(t-BHQ)组、桂皮醇组、桂皮醛组和桂皮酸组。模型对照组予以终浓度50 mg·L~(-1)的ox-LDL,孵育24 h造成细胞损伤模型,再予以终浓度20μmol·L~(-1)的t-BHQ,桂皮醇,桂皮醛和桂皮酸,孵育24 h后,MTT法检测细胞存活率,激光共聚焦扫描显微镜观察活性氧族(ROS)荧光强度,ELISA测定各组细胞内内源性氧化应激指标(SOD,MDA,NO,eNOS)的含量,qRT-PCR检测Nrf2 mRNA表达量。实验结果发现:ox-LDL能够诱导HBMEC内源性氧化应激损伤,3种桂枝汤苯丙烯类化合物对正常HBMEC细胞活性无抑制作用。与模型对照组比较,3种桂枝汤苯丙烯类化合物可显著或极显著的改变HBMEC氧化应激状态,上调损伤细胞Nrf2 mRNA表达量(P0.05,P0.01),其综合效应:桂皮醛特丁基对苯二酚桂皮酸桂皮醇,表明3种桂枝汤苯丙烯类化合物(20μmol·L~(-1))对ox-LDL(50 mg·L~(-1))诱导的HBMEC氧化应激损伤有较好的保护作用,其机制可能与核转录因子Nrf2调控其下游抗氧化酶基因表达相关。