Mmp-2重组真核表达载体的构建及MMP-2蛋白对肝癌细胞的作用机制探讨

目的：构建人基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2,MMP-2）基因重组真核表达载体,探讨MMP-2蛋白对肝癌细胞迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法：以肝癌SMMC-7721细胞为研究模型,以基因重组技术构建pEYFP-Mmp-2重组真核表达载体,pEYFP-Mmp-2一过性转染模型细胞过表达MMP-2-YFP,siRNA转染沉默模型细胞内源性MMP-2表达,设立空白对照、MMP-2沉默对照组、MMP-2沉默组、过表达MMP-2融合蛋白对照组、过表达MMP-2融合蛋白组,划痕实验检测细胞迁移能力,侵袭小室实验检测细胞侵袭能力,钙蛋白酶（calcium-activated neutral protease,Calpain）特异性抑制剂Calpeptin抑制Calpain活性,蛋白印记实验检测MMP-2、MMP-2-YFP、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vi－mentin）表达变化。结果：成功构建人Mmp-2重组真核表达载体pEYFP-Mmp-2。pEYFP-Mmp-2转染过表达MMP-2融合蛋白组细胞高表达MMP-2-YFP。与MMP-2沉默对照组相比,MMP-2沉默组内源性MMP-2表达明显下调（P=0.000）,细胞12 h、24 h及48 h迁移率明显降低（P=0.000或P=0.001）,48 h侵袭率明显降低（P=0.004）,E-cadherin表达明显上调,N-cadherin及Vimentin表达明显下调（P=0.000）。与过表达MMP-2融合蛋白对照组相比,过表达MMP-2融合蛋白组12 h、24 h及48 h迁移率明显增强（P=0.015或P=0.001）,48 h侵袭率明显升高（P=0.011）,细胞E-cadherin表达明显下调,N-cadherin及Vimentin表达明显上调（P=0.003或P=0.001）。Calpeptin预处理明显降低过表达MMP-2融合蛋白组细胞迁移率和侵袭率（P=0.000）,上调E-cadherin,下调N-cadherin及Vimentin蛋白表达水平（P=0.000）。结论：本实验通过基因重组技术成功构建人Mmp-2重组真核表达载体pEYFP-Mmp-2,成功表达MMP-2-YFP 融合蛋白;并发现MMP-2通过调节Calpain介导肝癌SMMC-7721细胞迁移、侵袭及EMT。     

芥子碱硫氰酸盐增强HepG2细胞对吉西他滨敏感性的作用

目的探讨芥子碱硫氰酸盐增强人肝癌细胞HepG2对吉西他滨敏感性的作用及分子机制。方法应用计算机分子对接技术分析芥子碱硫氰酸盐结合多耐药性相关蛋白ABCB1和ABCG2的能力,罗丹明123实验检测芥子碱硫氰酸盐对HepG2细胞外排药物能力的影响,CCK-8、克隆形成实验、流式细胞术分别检测芥子碱硫氰酸盐联合吉西他滨对HepG2细胞增殖、克隆形成、凋亡的影响,Western blot实验检测芥子碱硫氰酸盐联合吉西他滨对HepG2细胞中ABCB1、ABCG2、活化半胱天冬酶-8(Cleave caspase-8)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、凋亡相关基因(Bax)表达的影响。结果芥子碱硫氰酸盐可稳定结合多耐药性相关蛋白ABCB1、ABCG2,降低HepG2细胞外排药物的能力,增强吉西他滨对HepG2细胞增殖和克隆形成的抑制作用(P<0.05)及吉西他滨诱导HepG2凋亡的能力(P<0.05),抑制ABCB1、ABCG2蛋白表达,增强吉西他滨诱导的Bcl-2表达减少及Cleave caspase8、Bax表达增加(P<0.05)。结论芥子碱硫氰酸盐能靶向抑制多耐药相关蛋白ABCB1和ABCG2,增强肝癌HepG2细胞对吉西他滨的敏感性。