基于PERK/ATF4/CHOP的益肾通络方抑制内质网应激改善肾小管上皮细胞凋亡的作用机制

目的：验证益肾通络方(YSTLP)对肾小管上皮细胞凋亡的影响，并基于内质网应激通路蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/活化转录因子4(ATF4)/转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)探讨其作用机制。方法：将db/db小鼠随机分为模型组、缬沙坦组(10 mg·kg^-1·d-1)、YSTLP低、中、高剂量组(1、2.5、5 g·kg^-1·d^-1)给予药物干预8周后取材。同窝的db/m小鼠作为正常组。体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2)，分为正常组、糖基化终产物(AGEs)组、AGEs+益肾通络方低、中、高质量浓度组(100、200、400 mg·L^-1)；原位末端标记(TUNEL)染色检测HK-2细胞的凋亡情况；细胞活力测定实验检测HK-2细胞存活率；钙离子荧光探针染色，以及荧光素酶报告基因法检测为折叠蛋白反应元件(UPRE)荧光素酶活力，检测内质网应激情况；免疫组化法(IHC)检测小鼠肾脏中磷酸化(p)-PERK蛋白的表达(p-PERK)、CHOP、ATF4的蛋白表达水平；实时荧光定量聚合酶链式反应...     

目的

设计合成结构新颖的萘巯基氨基酸乙酯类组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1,LSD1)抑制剂,评价其LSD1抑制活性与选择性,并通过分子对接和动力学模拟探讨结合机制。

基于先导化合物3a与LSD1蛋白的结合模式,在化合物结构中固定平面疏水性的萘环,同时引入具有亲水性的氨基片段,采用三组份一锅法构建α-萘巯基氨基酸乙酯小分子化合物。采用课题组自主构建的LSD1筛选平台测试化合物在5.0,1.0 μmol·L^–1浓度下对LSD1的抑制率,测试活性最好的化合物的IC₅₀值及对MAO-A和MAO-B的抑制活性,并通过分子对接和动力学模拟研究其结合机制。

共合成13个目标化合物,均对LSD1有很好的抑制作用,其中有9个化合物在1.0 μmol·L^–1浓度下对LSD1抑制率>50.0%,且化合物3l活性最佳,IC₅₀值为0.17 μmol·L^–1,是阳性对照的174倍,对MAO-A和MAO-B有很好的选择性。分子对接和动力学模拟表明化合物3l通过多重作用与LSD1结合来抑制其活性。

α-萘巯基氨基酸乙酯类结构可作为先导化合物或活性片段,为基于结构的药物设计进行后续LSD1抑制剂的设计打下良好基础。

     

丹酚酸F调控Bax/Caspase-3/GSDME信号通路改善肾小管上皮细胞焦亡作用机制

目的 基于B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（Bax）/胱天蛋白酶-3（Caspase-3）/消皮素E（GSDME）通路探讨丹酚酸F改善高糖诱导的肾小管上皮细胞（HK-2）损伤的机制。方法 细胞增殖与活性检测（CCK-8）法检测不同浓度（2.5、5、10、20 μmol·L^-1）丹酚酸F对高糖诱导的HK-2细胞相对活力的影响及给予丹酚酸F不同干预时间条件下HK-2细胞的相对活力;乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒和酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒分别检测细胞培养基上清中LDH和白细胞介素-1β（IL-1β）的含量;流式细胞术结合异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）和Hoechst 33342/PI染色检测丹酚酸F对高糖诱导的HK-2细胞PI阳性率的影响;蛋白免疫印迹法（Western blot）评价丹酚酸F对高糖诱导的HK-2细胞中Bax、Bcl-2、细胞色素C（Cyt C）、胱天蛋白酶-9（Caspase-9）、Caspase-3、GSDME蛋白表达及激活情况的影响。2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针法（DCFH-DA）及线粒体膜电位（JC-1）考察丹酚酸F对高糖诱导的HK-2细胞中活性氧（ROS）产生及线粒体膜电位的影响。结果 与空白组比较,模型组细胞活力显著降低（P<0.01）,乳酸脱氢酶、炎症因子IL-1β、PI阳性细胞比例均显著升高（P<0.01）;Bax、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3、GSDME蛋白表达显著升高（P<0.01）,Bcl-2蛋白表达显著降低（P<0.01）,HK-2细胞线粒体膜电位的降低,ROS产生过量蓄积。与模型组比较,丹酚酸F组有效改善高糖诱导所致HK-2细胞的损伤（P<0.05）,明显降低细胞培养基上清中LDH及IL-1β含量（P<0.05,P<0.01）,显著减少PI阳性细胞的比例（P<0.01）;丹酚酸F组降低Bax、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3、GSDME蛋白表达,明显升高Bcl-2蛋白表达（P<0.05,P<0.01）,HK-2细胞线粒体膜电位的升高,ROS的过量蓄积减少。结论 丹酚酸F通过减少ROS的产生,改善线粒体膜电位失衡,抑制Bax/Caspase-3/GSDME信号通路介导的细胞焦亡发挥改善高糖诱导所致HK-2细胞损伤的作用。     

基于NLRP3/CASP1/GSDMD通路探讨益肾通络方抑制糖尿病肾脏疾病小鼠足细胞焦亡的作用机制

目的 观察益肾通络方(熟地黄、黄芪、山萸肉、丹参、大黄、鬼箭羽、血竭)对db/db小鼠足细胞及小鼠肾足细胞MPC-5焦亡的影响,探讨其抑制糖尿病肾脏疾病足细胞焦亡改善足细胞损伤的可能作用机制。方法 (1)体内实验。以db/db小鼠(模型组及各给药组)及同窝对照db/m小鼠(对照组)为研究对象。db/db小鼠按体质量随机分为5组,除模型组外,其余4组分别按照每日1.0、2.5、5.0 g/kg剂量给予益肾通络方及10 mg/kg缬沙坦灌胃,模型组及对照组给予等量蒸馏水。治疗8周后,透射电子显微镜观察小鼠肾脏组织中足细胞数量与形态变化情况;对肾脏组织进行TUNEL染色,同时利用免疫荧光技术标记足细胞标志蛋白Wilms瘤基因1(WT-1);酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测小鼠血清白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)水平;利用实时荧光定量PCR、Western blotting检测小鼠肾脏组织中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶-1(CASP1)、焦孔素D(GSDMD)mRNA及蛋白表达和激活情况。(2)体外实验。以糖基化终末期产物(AG...     

基于LKB1/AMPK/PGC-1α的泽泻汤改善非酒精性脂肪肝作用机制研究

以棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导的脂质堆积细胞模型和高脂诱导的非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)动物模型,探讨泽泻汤(Zexie Decoction)体内外改善NAFLD的药效,以LKB1/AMPK/PGC-1α通路为切入点探讨其可能作用机制。MTT结果显示泽泻汤对HepG2细胞活力无影响,泽泻汤剂量依赖性下调PA诱导的肝细胞培养基谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)的水平,降低高脂饮食(high-fat diet,HFD)小鼠血浆ALT、AST及肝脏总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)水平。尼罗红染色观察PA诱导的细胞内脂质沉积,PA诱导的肝细胞脂质蓄积显著增加,体外细胞脂质堆积模型诱导成功,泽泻汤有效改善PA诱导的肝细胞脂质堆积;小鼠肝脏油红染色结果同样表明,泽泻汤剂量依赖性减少HFD小鼠肝脏脂质堆积。线粒体膜电位染色显示泽泻汤能够逆转PA诱导肝细胞损伤引起的线粒体膜电位的下降;同时泽泻汤激活PGC-1α上调其靶基因ACADS、CPT-1α、CPT-1β、UCP-1、ACSL-1、NRF-1等的表达;Western blot及免疫组化结果显示泽泻汤可体内外上调LKB1、p-AMPK、p-ACC、PGC-1α蛋白表达水平。综上所述,泽泻汤能够有效改善NAFLD,其机制可能与调控LKB1/AMPK/PGC-1α通路相关。     

黄芪化学成分抗纤维化作用及分子机制研究进展

纤维化是指多类型的组织损伤,尤其是在慢性炎症反应性疾病过程中,组织修复平衡失调的终末结局。纤维化可发生于多种器官组织中,其持续进展可能导致器官功能障碍和衰竭,对人类健康构成了巨大的威胁。中药在预防和治疗纤维化方面有显著的治疗效果,具有多成分、多途径和多靶点的特点,已成为纤维化领域研究的热点。补气类中药黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的根,具有益气升阳、生津养血、托毒排脓、敛疮生肌的功效。黄芪含有多糖类、皂苷类和黄酮类等化学成分,具有较好的抗炎、抗氧化等作用,可有效干预心脏、肾脏、肝脏和肺脏等多脏器组织的纤维化进程。该文综述了黄芪及其化学成分的抗纤维化药效作用及其机制,可为黄芪的进一步研究和应用提供思路和参考。     

血竭化学成分及其糖尿病肾脏疾病肾小管损伤保护作用评价

采用大孔树脂、硅胶、葡聚糖凝胶、高效液相等色谱手段,对中药血竭的化学成分进行初步研究,分离得到1个反式二氢查耳酮类、4个黄烷类和1个二苯乙烯类化合物。通过现代波谱学、理化性质和文献比对鉴定其化学结构,分别鉴定为4-羟基-2,6-二甲氧基-3-甲基二氢查耳酮(1)、4′-羟基-5,7-二甲氧基-8-甲基黄烷(2)、7-羟基-4′,5-二甲氧基黄烷(3)、(2S)-7-羟基-5-甲氧基-6-甲基黄烷(4)、(2S)-7-羟基-5-甲氧基黄烷(5)、紫檀芪(6),其中化合物1为新化合物,化合物2和6为从棕榈科中首次分离得到。化合物5具有防治糖尿病肾脏疾病的潜力。     

基于SREBPs通路的益肾通络方改善脂质代谢异常作用机制研究

目的 基于固醇调节元件结合蛋白（SREBPs）通路探究益肾通络方改善脂质代谢异常的作用机制。方法 以C57BLKS/J(db/db)小鼠为模型动物、 C57BLKS/J(db/m)小鼠为正常对照,通过测定小鼠肝脏系数及血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）含量,观察小鼠肝组织脂肪变性和脂质蓄积情况,测定小鼠肝组织中SREBP-1、SREBP-2蛋白和Srebp-1c、Srebp-2及其下游脂质代谢相关靶基因（Fasn、Acc1、Scd5、Fads1、Hmgcr、Dhcr24、Insig-1、Fdps）的mRNA转录水平,来考察1、2.5、5 g/kg益肾通络方改善db/db小鼠脂质代谢异常的作用机制。以低脂培养的人肝癌细胞HepG2为体外脂质代谢异常细胞模型,以25-HC(SREBPs抑制剂,10μmol/L)为抑制剂对照,考察125、250、500μg/mL益肾通络方干预24 h后对细胞中SREBP-1、SREBP-2蛋白和SREBP-1c、SREBP-2其下游脂质代谢相关靶基因mRNA转录水平的影响,进行体外机制验证。结果1、2.5...     

基于GRP78/PERK/ATF4的泽泻汤改善脂质诱导肝细胞内质网应激作用机制研究

目的:基于GRP78/PERK/ATF4通路探讨泽泻汤改善肝细胞内质网应激的潜在机制。方法:采用油酸(OA)及高脂饮食诱导高脂细胞及动物内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)模型。ER与Ca²⁺荧光共定位观察泽泻汤对ER-Ca²⁺稳态的调节情况;流式细胞术及Tunel法检测泽泻汤对凋亡的影响;Q-PCR检测ER核心信号1(Ern1)、转录激活因子6(Atf6)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein,Chop)、Grp78、Perk、X-盒结合蛋白1(Xbp1)、热休克蛋白90β1(Hsp90β1)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10B(Tnfrsf10b)的mRNA表达;Western bolt法检测葡萄糖调节蛋白78/B细胞免疫球蛋白结合蛋白(GRP78/BIP)GRP78、类PKR的内质网激酶(PERK)、p-PERK和转录激活因子4(ATF4)的蛋白表达。结果:与正常对照组相比,模型对照组ER-Ca