LED光源照射及PI3K抑制剂对人视网膜色素上皮细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨LED光源照射对人视网膜色素上皮（RPE）细胞自噬和凋亡的影响,以及磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂LY294002在光照下对RPE细胞自噬和凋亡的影响。方法体外培养人ARPE-19细胞,随机分为6h对照组、6h模型组、6hLY294002组,12h对照组、12h模型组、12hLY294002组,24h对照组、24h模型组、24hLY294002组,分别给于设定时间的LED冷光照射或加入LY294002后的光照。采用噻唑蓝法检测各组细胞存活率;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;透射电子显微镜观察各组细胞超微结构;构建稳定表达红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3（LC3）的RPE细胞株,激光共聚焦合倒置荧光显微镜分析细胞自噬流变化;Westernblot法检测苄氯素1（Beclin1）、LC3和p62自噬相关蛋白表达水平。结果与对照组比较,6、12、24h模型组细胞存活率均下降（均P＜0.05）,12、24hLY294002组细胞存活率均下降（均P＜0.01）;与模型组比较,12、24hLY294002组细胞存活率均升高（均P＜0.05）。与对照组比较,6、12、24h模型组和LY294002组细胞凋亡率均升高（均P＜0.05）;与模型组比较,6、12hLY294002组细胞凋亡率均下降（均P＜0.05）。模型组RPE细胞在光照24h后,胞内可见较多的自噬泡,LY294002干预后也可见聚集性分布的自噬囊泡。观察自噬流发现,对照组少见红色亮点,模型组红色亮点荧光随光照时间延长数量逐渐增多,Merge图中黄色亮点数量增多明显,LY294002干预后,红色亮点与黄色亮点呈增多趋势。与对照组比较,6、12、24h模型组和LY294002组细胞中Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平均升高,p62蛋白表达水平均下降,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;与模型组比较,6、12、24hLY294002组细胞中Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达均升高,12、24hLY294002组细胞中p62蛋白表达水平均下降,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论LED光源照射可刺激ARPE-19细胞发生自噬,增加细胞凋亡率;PI3K抑制剂LY294002能上调细胞的自噬活性,减缓凋亡。     

枸杞多糖通过miRNA-21-5p靶向PTEN调控PI3K/Akt/mTOR通路抗人视网膜色素上皮细胞光损伤机制

目的：研究枸杞多糖（LBP）对光诱导人视网膜色素上皮（RPE）细胞凋亡作用的影响及其保护机制。方法：将体外培养的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）随机分为空白对照组,模型组,枸杞多糖低、中、高剂量组,建立人RPE细胞光损伤模型,于光照24 h后进行相应指标检测。采用CCK-8法检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;qRT-PCR法检测miRNA-21-5p、PTEN mRNA表达水平;Western Blot法检测PTEN、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR蛋白表达量。结果：与空白对照组比较,模型组细胞存活率显著降低,细胞凋亡率显著升高,miRNA-21-5p表达显著下降,PTEN mRNA表达显著升高,PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平显著降低,PTEN蛋白表达量显著升高（P<0.01）;与模型组比较,枸杞多糖低、中、高剂量组细胞存活率显著升高,细胞凋亡率显著下降,miRNA-21-5p表达显著升高,PTEN mRNA表达均显著降低,PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平均显著...     

雷帕霉素对光诱导下视网膜色素上皮细胞自噬的影响

目的：探讨雷帕霉素对光诱导下视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）自噬的影响。方法：将自噬双标mRFP-eGFP-LC3质粒转染进ARPE-19细胞中获得稳定表达的转染细胞株,随后随机分为6 h对照组、6h模型组、6 h雷帕霉素组;12 h对照组、12 h模型组、12 h雷帕霉素组和24 h对照组、24 h模型组、24 h雷帕霉素组。对照组避光培养,模型组受光照刺激;雷帕霉素组加入10μmol/L雷帕霉素后受光照刺激,光源采用LED冷光灯,在（16 500±500） lx光照强度下照射细胞6、12、24 h。检测转染效率,MTT检测ARPE-19细胞存活率;激光共聚焦显微镜对自噬流变化进行定性分析,透射电镜观察细胞自噬形态;蛋白免疫印迹法对Beclin1、LC3、P62自噬相关蛋白表达量进行检测。结果：与对照组相比,模型组光照6、12、24 h后,细胞存活率显著下降（P<0.001）;雷帕霉素组经光照后细胞存活率高于模型组（P<0.05）。光照6、12、24 h后模型组红色荧光斑点较对照组逐渐增多,绿色荧光斑点也随之增加,Merge图中从光照12 h开始黄色斑点数量增多明显。...     

不同纯度枸杞多糖对光诱导人RPE细胞氧化应激损伤保护作用研究

目的：观察不同纯度枸杞多糖（LBP）对光诱导人视网膜色素上皮（RPE）细胞损伤的抗氧化作用。方法：体外培养人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）,建立光诱导下hRPE细胞损伤模型,加入不同纯度的枸杞多糖（50%、65%）对hRPE细胞进行干预并于24h后进行相应指标检测。CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术（FCM）检测细胞内活性氧自由基（ROS）、细胞超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的含量。实验组分为正常组、模型组、不同纯度枸杞多糖（50%、65%）干预组。结果：与正常组比较,模型组细胞存活率明显降低,SOD活力明显下降,ROS、MDA明显升高（P<0.01）;与模型组比较,不同纯度枸杞多糖（50%、65%）干预组细胞存活率明显升高,SOD活力明显上升,ROS、MDA呈下降趋势（P<0.01）;65%枸杞多糖组较50%枸杞多糖组细胞存活率明显升高,SOD活力呈上升趋势,ROS、MDA明显下降（P<0.01）。结论：枸杞多糖可保护光诱导的hRPE细胞氧化损伤,随着枸杞多糖纯度提高,其保护作用更显著。     

miRNA-21-5p对光诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤的影响

目的 研究miRNA-21-5p对光诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤的影响。方法 将体外培养的人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞随机分为对照组(TransIntro EL Transfection Reagent转染液培养)、损伤组(TransIntro EL Transfection Reagent转染液+光损伤)、过表达组(TransIntro EL Transfection Reagent转染液+miRNA-21-5p mimics+光损伤)、阴性组(TransIntro EL Transfection Reagent转染液+miRNA-21-5p mimics NC+光损伤)、PI3K/Akt阻断剂组(TransIntro EL Transfection Reagent转染液+miRNA-21-5p mimics+LY294002+光损伤)。使用光照强度为(16 500±200) lx的LED冷光灯建立ARPE-19细胞光损伤模型，利用TransIntro EL Transfection Reagent转染液行细胞转染。采用qRT-PCR法检测各组ARPE-19细胞...