小鼠水通道蛋白1基因shRNA慢病毒载体构建与鉴定

目的 应用RNA干扰技术,构建小鼠水通道蛋白1(AQP1)基因重组慢病毒载体并鉴定.方法 对小鼠AQP1 mRNA分析,设计合成的单链引物经退火形成双链寡核苷酸序列,连接入经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切线性化的pLKO.1-TRC慢病毒质粒载体中,菌液PCR鉴定并经测序验证.测序正确后与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞,收集病毒上清经高速离心浓缩后感染小鼠小胶质细胞BV-2,Western blot法分析筛选有效shRNA序列.结果 成功退火合成3对发夹shRNA序列并将其克隆到pLKO.1-TRC载体中,构建重组质粒pLKO-AQP1-SH1、2、3,经菌液PCR鉴定和测序验证载体构建成功.Real-time PCR检测发现重组质粒pLKO-AQP1-SH2感染BV-2细胞后AQP1 mRNA表达最低,Western blot结果进一步验证结果的准确性.结论 成功构建出AQP1基因shRNA慢病毒载体.     

ICOS-Ig 融合蛋白联合亚剂量环孢素A诱导小鼠移植心脏长期存活

目的 探讨可诱导共刺激分子-Ig融合蛋白(ICOS-Ig)联合亚剂量环孢素A(CsA)对小鼠移植心脏存活时间的影响及其机制.方法 自行构建ICOS-Ig.以Balb/c小鼠为供者,C57BL/6小鼠为受者,套管法制备小鼠颈部心脏移植模型,然后将模型分为5组:(1)未处理组,不做任何处理;(2)对照IgG组,移植当天以及术后第2、4、6天腹腔注射IgG 250 μg;(3)IcoS-Ig组,移植当天以及术后第2、4、6天腹腔注ICOSIg250 μg;(4)CsA组,移植当天以及术后第1～7天腹腔注射CsA 10mg/kg;(5)ICOS-Ig+CsA组,同时给予ICOS-Ig和CsA,使用时间和剂量同前.术后观察移植心脏存活时间,观察移植后第7天移植心脏的病理变化,并进行供、受者混合淋巴细胞反应(MLR),测定受者血清中供者特异性的同种抗体水平.结果 各组小鼠移植心脏存活时间分别为:未处理组(8.5±1.5)d,对照IgG(8.00.8)d,ICOSIg(29.57.7)d.CsA处理组(21.0±5.0)d,ICOS-Ig+CsA组移植心脏存活时间均超过50d,6只(6/9)移植心脏存活时间>100d,ICOS-Ig+CsA组与其他4组比较,差异均有统计学意义(P<0.01).移植后7d,未处理组及对照IgG组心肌明显变性,纤维断裂,间质水肿,肌束间及血管周围有大量炎症细胞浸润,而ICOS-Ig组和CsA组心肌无明显变性,间质略水肿,血管周围有少量淋巴细胞浸润,ICOS-Ig+CsA组的病理改变明显I(X)S-Ig组和CsA组.移植后7d,ICOS-Ig组和CsA组的脾脏淋巴细胞对同种抗原刺激反应比未处理组和对照IgG组明显降低(P<0.05),而ICOS-Ig+CsA组的抑制作用明显强于ICOS-Ig组和CsA组(P<0.05).移植后7d,ICOS-Ig组和CsA组受者血清中针对特异性供者的抗体水平明显低于未处理组和对照IgG组(P<0.05),ICOS-Ig+CsA组的抗体水平明显低于ICOS-Ig组和CsA组(P<0.05).结论 ICOS-Ig可以降低受者对供免疫反应性,延长移植心脏的存活时间,联合亚剂量CsA可使异体移植心脏长期存活.     

乳鼠肌源性干细胞向许旺样细胞的诱导分化

背景：有证据显示,肌源性干细胞能够促进肌纤维的再生,增强再生肌组织的功能,并具有分化为神经外膜组织细胞和具有许旺细胞表型细胞的潜能。 目的：分析许旺细胞条件培液诱导小鼠乳鼠源肌源性干细胞向许旺细胞的分化,探讨其作为神经组织工程的种子细胞的可行性。 方法：取C57BL/6乳鼠四肢骨骼肌,采用改良的Preplate技术纯化培养肌源性干细胞,利用抗体Desmin和Sca-1对纯化后的细胞进行免疫细胞化学鉴定。采用许旺细胞条件培液诱导其向许旺细胞分化,并行许旺细胞特异性抗体S100β、P75NTR免疫细胞化学鉴定。 结果与结论：从小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞,能在体外稳定增殖传代,Desmin和Sca-1免疫细胞化学染色阳性。肌源性干细胞经体外诱导分化后部分细胞S100β、P75NTR染色阳性。说明应用改良的Preplate方法,可从新生小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞;采用许旺细胞条件培液能将其诱导分化为许旺样细胞,有可能成为神经组织工程神经较理想的许旺细胞替代物。     

落新妇苷对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用

目的：探讨落新妇苷对大鼠肾脏缺血再灌注（ischemia reperfusion,IR）损伤的保护作用。 方法：将24只健康雄性SD大鼠随机分成假手术组、模型组和落新妇苷组,每组8只。模型组和落新妇苷组大鼠用于制作肾脏IR模型。自术前3d开始,落新妇苷组大鼠腹腔注射12mg／mL落新妇苷30mg／kg,1次／d;模型组大鼠腹腔注射等量生理盐水。于再灌注6h后检测各组大鼠血清尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）和肌酐（serum creatinine,SCr）水平,并观察肾组织形态学变化;半定量逆转录聚合酶链式反应及蛋白印迹法检测肾组织内单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein—1,MCP-1）mRNA及蛋白表达水平;酶联免疫吸附测定法检测各组大鼠血清白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）和白细胞介素18（interleukin—1β,IL-1β）含量。 结果：再灌注6h后与模型组相比,落新妇苷组大鼠BUN和SCr水平均显著降低（P〈0．01）,大鼠肾小球及肾小管上皮细胞损伤明显减轻,肾组织内MCP-1 mRNA（P〈0．05）和蛋白表达下降,血清IL-6和IL-1β含量下降（P〈0．01）。 结论：落新妇苷能够有效减轻肾脏IR损伤,其保护作用可能与抑制IR后趋化因子MCP-1及细胞因子IL-6和IL-1β的产生有关。     

舌形瓣法乳头男性化手术临床应用体会

目的:探讨女复男易性病患者乳头男性化的舌形瓣法手术治疗效果。方法:在原乳头12点方向及6点方向设计两个蒂在乳头基底部的对称舌形皮瓣,皮瓣蒂部宽约8mm,皮瓣长约6mm,手术切除两舌形瓣之间多余的乳头组织,舌形瓣对应间断缝合,形成新男性化乳头。结果:对78例女复男易性病患者实施了舌形瓣法乳头缩小术,乳头组织瓣血运好,全部成活,新乳头大小约5mm×4 mm,取得男性化的满意效果,无乳头坏死现象。结论:乳头舌形瓣设计灵活、血运可靠,方法易掌握,乳头男性化外观逼真,是女复男易性病及男性乳头肥大患者行乳头缩小美容的良好选择。     

应用改良差速贴壁法和有限稀释技术分离培养小鼠来源肌源干细胞

背景：研究者们通过多种方法从肌组织中分离得到肌源干细胞,并应用于各类组织工程和再生医学研究。 目的：结合改良的差速贴壁法和有限稀释技术分离小鼠来源肌源干细胞,并培养其单细胞克隆和亚克隆集落。 方法：以新生C57BL/6小鼠四肢作为肌组织取材对象,经三重酶消化和细胞筛过滤,运用改良的差速贴壁法分离出肌源干细胞,予细胞特异标记物以免疫组织化学染色;以有限稀释技术克隆培养的方法,获得稳定的肌源干细胞单克隆和亚克隆集落。 结果与结论：差速贴壁培养过程中,肌性细胞占比逐渐增高,首次贴壁1 h可以获得足够数量的细胞进行第6次贴壁培养;肌源干细胞需72 h左右贴壁生长,经10 d左右可以增殖为300~500细胞数量的集落,细胞形态以小圆形细胞为主,并有少量梭形细胞,肌源干细胞能够维持形态并持续增殖;应用有限稀释技术可获得肌源干细胞单克隆和亚克隆集落,肌源干细胞克隆细胞均呈现Desmin染色阳性,Sca-1染色阳性,阳性率为(92.3±4.1)%。提示应用preplate法和有限稀释技术可以分离得到小鼠来源肌源干细胞及其克隆集落。     

体外转染可溶性IL-1RI-Ig基因延长糖尿病小鼠移植胰岛细胞存活时间

目的 探讨糖尿病小鼠移植经可溶性白细胞介素1(IL-1)受体胞外段Fc融合蛋白(sIL-1RI-Ig)基因修饰的胰岛细胞对延长移植物存活时间的作用及机制.方法 将Ad-sIL-1RI-Ig体外转染Balb/c小鼠的胰岛细胞,并将其移植给糖尿病C57BL/6小鼠,观察移植物的存活时间,并检测移植局部组织炎症细胞的浸润以及炎症细胞因子的表达.结果 糖尿病小鼠移植转染sIL-1RI-Ig基因的胰岛细胞后,血糖水平很快下降至正常范围,胰岛移植物存活时间达(39±3)d,而移植正常胰岛细胞的小鼠胰岛移植物存活时间为(9±2)d(P<0.01).糖尿病小鼠移植转染sIL-1RI-Ig基因的胰岛细胞后,胰岛素分泌量随糖负荷增加而升高,并与胰岛素分泌功能正常的小鼠呈相似变化趋势(P>0.05).糖尿病小鼠移植转染sIL-1RI-Ig基因的胰岛细胞后,移植局部组织表达肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)和RANTES等水平明显下调;病理学观察发现移植局部组织浸润的炎症细胞明显少于移植正常胰岛细胞的小鼠.结论 sIL-1RI-Ig基因转染胰岛细胞后,可通过表达sIL-1RI-Ig,阻断IL-1的作用,降低TNF-α、IFN-γ、RANTES等细胞因子的表达,从而减轻排斥反应,延长胰岛细胞移植物的存活时间和提高胰岛素分泌功能.     

大鼠原位肝移植模型的手术技巧

目的探讨建立稳定的大鼠原位肝移植模型的外科手术技巧,为研究肝脏缺血再灌注损伤提供技术支持。方法110只雄性SD大鼠随机配对后分别作为供体和受体,通过改良Kamada"二袖套"法施行大鼠原位肝移植。结果改良Kamada法建立大鼠原位肝移植模型共52例,7d生存率88.5%,7例长期存活大于100d。结论大鼠原位肝移植模型的建立需要极度的耐心和娴熟的手术技巧,模型的建立有助于研究肝脏缺血再灌注损伤,移植免疫及器官保存。     

传统温针针体导热的实验研究

<正> 传统温针作为一种传统的外治疗法已有几千年的历史。近年来应用现代技术手段对温针的研究也取得了一定的成就,上世纪90年代诞生的WJ-电热艾针仪(蒙医疗术温针仪)在完全模拟传统温针的基础上使其得以提高,并广泛地应用于临床。传统温针热效应的传导,多年来一直是对温针治疗机理探讨的核心。目前,有许多关于温针的科研课题及临床应用观察,自在对传统温针在规范化上得以提高。对于温针研究的技术关键是热传导问题,在探讨温针的作用机理时,大多认为,通过艾绒在毫针或银针针柄上的燃烧,将针柄加热,热效应     

创面负压吸引在阴股沟皮管成形术中的应用研究

目的：探讨创面负压吸引在阴股沟皮管成形术中的临床应用效果。方法：将52例行双侧阴股沟皮管成形术的患者,随机选取一侧作为观察组共52例,自身另一侧作为对照组共52例,采用自制的负压吸引装置进行治疗。术后5d连续观察皮管肿胀情况,皮管颜色及切口引流。结果：观察组除1例因包扎不当形成皮管束带状压迫造成局部静脉回流障碍,经及时纠正后症状消除,本组52例均一期愈合。对照组肿胀均较观察组明显,5例皮管出现血肿,予血肿清除术,另有3例皮管在远端蒂部出现皮下积液,经换药引流后延迟愈合。结论：持续负压吸引与常规加压包扎相比,效果确实,并发症发生率低,减轻患者痛苦,费用较低。