川牛膝MSAP反应体系的优化及引物筛选

目的：首次对川产道地药材川牛膝表观遗传多样性进行研究,建立并优化川牛膝甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）最佳反应体系。方法：以川牛膝苗期叶片为材料,利用正交试验设计对川牛膝MSAP反应体系中预扩增和选择性扩增中关键影响因素进行考察,建立川牛膝MSAP反应最佳体系。结果：川牛膝MSAP最佳反应体系为：酶切体系（20 μL）,300 ng DNA、1.5 μL EcoRI、1.5 μL HpaII或1.5 μL MspI（HpaII）;连接体系（25 μL）：15 μL酶切产物、1 μL EcoRI adaptor、1 μL HpaII/MspI adaptor、0.2 μL T4连接酶;预扩增体系（25 μL）：连接产物1 μL、rTaq酶1 U、引物分别1.5 μL、dNTP 2 μL;选择性扩增体系（25 μL）：预扩产物稀释50倍、rTaq酶1 U、引物1.5 μL、dNTP 3 μL,并运用优化后的体系,最终从川牛膝MSAP的256对引物中筛选出有效引物6对。结论：优化后的体系保证了稳定的图谱、清晰的条带,筛选出的6对引物组合特异性好,能够用于后续川牛膝DNA甲基化相关实验研究,同时,为其他药用植物MSAP分析提供了参考。