用多重PCR技术检测小管福寿螺体内广州管圆线虫幼虫

目的建立一种多重PCR方法检测小管福寿螺体内的广州管圆线虫幼虫。方法根据广州管圆线虫核糖体小亚基rDNA基因序列(GenBank登录号为AY295804)设计特异性引物,并与小管福寿螺16srDNA的特异性引物组合,建立多重PCR检测方法。分别以阳性和阴性小管福寿螺DNA为模板进行多重PCR扩增,电泳鉴定并测序。用阴性小管福寿螺DNA倍比稀释200条广州管圆线虫Ⅲ期幼虫DNA模板,使之浓度分别为1200ng/μl、120ng/μl、12ng/μl、1200pg/μl、120pg/μl和12pg/μl,检测该方法的敏感性。野外采集小管福寿螺172只,肺检法检测后,进行多重PCR扩增,计算敏感性和特异性。结果电泳和测序结果证实该多重PCR检测方法能有效扩增出目的片段,小管福寿螺和广州管圆线虫的目的片段分别为550和405bp。该方法可检测出广州管圆线虫Ⅲ期幼虫DNA的最小浓度为120pg/μl。肺检法和多重PCR法检测均为阳性结果的45只,两法均为阴性的100只。肺检法为阴性、多重PCR法为阳性的24只,肺检法为阳性而多重PCR法检测为阴性的3只。多重PCR的敏感性和特异性分别为93.8%(45/48)和80.6%(100/124)。多重PCR法的阳性检出率为40.1%(69/172),肺检法阳性检出率为27.9%(48/172),差异具有统计学意义(χ2=14.8,P0.01)。结论建立了检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的多重PCR方法。     

环介导等温扩增法检测人粪样中美洲钩虫的方法建立

目的 建立一种快速、高效的环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测粪样中美洲钩虫虫卵。方法 根据美洲钩虫ITS基因序列,设计4条LAMP引物,建立LAMP检测法。利用LAMP法检测日本血吸虫、肝吸虫、鞭虫、猪蛔虫、蛲虫的DNA样本以验证LAMP方法的特异度。以美洲钩虫成虫DNA样本,倍比稀释以评价LAMP法的DNA最低检出量。现场采集55份人粪DNA样本,采用改良加藤法、LAMP法和普通PCR方法同时检测,评价LAMP法的敏感性和特异性。结果 LAMP法可特异性扩增美洲钩虫DNA样本。LAMP法可检测最低DNA浓度为1.2 fg/mL。通过现场样本对LAMP进行评价,LAMP法敏感性相对于改良加藤法和PCR法分别是95.24%和100%。特异性分别是97.06%和100%。结论 建立起以虫卵为检测材料的检测美洲钩虫病的LAMP法,为美洲钩虫病提供特异、敏感、高效的检测方法。     

我国利什曼原虫伽师株有毒力和无毒力前鞭毛体定量蛋白质组学比较分析

目的 应用定量蛋白质组学方法比较我国利什曼原虫伽师株有毒力和无毒力前鞭毛体蛋白表达的差异。方法 将分离于我国新疆伽师县黑热病患者婴儿利什曼原虫JS5有毒力株前鞭毛体和无毒力株前鞭毛体经酶解后进行液相色谱串联质谱(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)的非标记(Label-free)定量分析,利用MaxQuant软件查库,进行Label-free非标定量(LFQ)分析;每个样品重复3次质谱分析,只有1次有LFQ值的蛋白舍弃。结果 本研究共鉴定蛋白3 994个,有毒力和无毒力株间差异蛋白为298个(差异倍数>1.2或差异倍数<0.83,P<0.05),其中利什曼原虫有毒力株前鞭毛体特有表达蛋白15个,无毒力株前鞭毛体特有表达蛋白23个,二者间表达丰度有显著差异蛋白260个,其中有毒力前鞭毛体表达上调蛋白(高表达)78个,表达下调蛋白(低表达)182个。这些差异表达蛋白中已鉴定功能的蛋白分别涉及糖与脂质代谢、核酸代谢、压力反应、细胞骨架形成、细胞周期与增殖等生物功能。结论 利什曼原虫伽师株有毒力株和无毒力株前鞭毛体蛋白质组的表达存在差异,为筛选和鉴定与利什曼原虫感染相关关键分子奠定了基础。     

基于PCR蜱体内巴贝虫检测方法的评价

目的分别对4种牛体表蜱体内巴贝虫和两种犬体表蜱体内巴贝虫基于PCR的检测方法进行评价。方法在广西壮族自治区6个市的62个村,现场采集犬和牛体表蜱。巢式PCR特异性扩增巴贝虫18s rDNA,纯化阳性样本的PCR产物、测序、比对,以确定感染的病原体。应用双重PCR、双重巢式PCR、双重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测牛体表蜱内病原体双芽巴贝虫(Babesia bigemina)和牛巴贝虫(B.bovis)的感染情况。应用多重PCR检测犬体表蜱的犬巴贝虫(B.canis canis)、佛氏巴贝虫(B.canis vogeli)和罗氏巴贝虫(B.canis rossi)的感染情况。将各方法的检测结果进行比较,对检测方法进行评价。结果采集牛体表蜱102只。巢式PCR、双重PCR、双重巢式PCR检测牛体表蜱内双芽巴贝虫和牛巴贝虫均为阴性,双重LAMP的浊度仪检测结果为5例阳性,颜色观测结果阳性样本为29例,该29例包含浊度仪检测的5例阳性。采集犬体表蜱184只。巢式PCR检测出犬体表蜱佛氏巴贝虫阳性样本9例。其中4例被多重PCR检测出佛氏巴贝虫阳性。同时多重PCR检测检出罗氏巴贝虫阳性样本4例,经测序均为罗氏巴贝虫阴性。结论双重PCR、双重巢式PCR检测牛体表蜱体内巴贝虫未出现假阳性情况,巢式PCR检测微小巴贝虫,双重PCR、双重巢式PCR未发生交叉反应,说明其具有一定特异性,但因无阳性样本,敏感度需要进一步评价。双重LAMP颜色观测结果阳性率15.76%,浊度仪测出阳性率2.72%,其中双重LAMP颜色观测法2例阳性样本为巢式PCR微小泰勒虫阳性(Theieria microti)。双重LAMP法直观快捷,但对其检测的阳性样本需进行进一步确认,同时由于该方法的高度敏感性,需注重预防实验污染。犬体表蜱多重PCR可一次鉴别3种犬巴贝虫,鉴于在本研究中的假阳性和假阴性情况,多重PCR不适用,建议将病原体独立检测。     

鄂产黄药子对小鼠免疫功能影响的实验研究

 目的 研究鄂产黄药子对小鼠免疫功能的影响。 方法 将昆明小鼠随机分为高、中、低 3 个剂量组,用鄂产黄药子水煎剂进行等容量灌胃,总剂量分别为 1 000 , 490 和 240 g·kg^-1 。另设对照组灌服同体积的生理盐水。连续灌服 15 d 后,用乳酸脱氢酶释放法、碳粒廓清实验进行非特异性免疫检测;用定量溶血分光光度法进行体液免疫检测;用 <> α - 醋酸萘酯酶染色法、四甲基偶氮唑蓝法进行细胞免疫检测。 结果 与对照组相比较,高剂量组能明显降低小鼠巨噬细胞的吞噬作用,而中剂量组能增强小鼠自然杀伤细胞的活性、抗体形成细胞数量、血 T 淋巴细胞酯酶染色率、 T 淋巴细胞增殖能力。 结论 总体上,高剂量鄂产黄药子具有免疫抑制的功能,中剂量具有免疫增强的功能。     

提纯小管福寿螺DNA6种方法的比较研究

目的以不同方法提纯小管福寿螺DNA,用PCR检测以比较其效果。方法将80只野外采集的小管福寿螺分8组,取出肺囊并剪碎后分别用QIAGEN、天根、OMEGA的基因组DNA抽提试剂盒,及异硫酸氰胍抽提法、树脂抽提法和树脂-二氧化硅抽提法提纯小管福寿螺基因组DNA,用PCR扩增福寿螺16s rDNA,测定目的条带相对浓度以评价各方法的抽提效果。结果各种方法提纯的基因组DNA均能用PCR扩增方法扩增出目的条带,但目的条带浓度有一定差异。其中,QIAGEN公司和OMEGA公司的抽提试剂盒、树脂抽提法和树脂-二氧化硅抽提法提纯的模板PCR扩增量较高,与其余4种抽提方法比较有统计学意义。试剂盒抽提法的单价成本是手工抽提法的8.4～57.1倍。结论QIAGEN和OMEGA公司的基因组DNA抽提试剂盒的提纯效果好,但成本较高,适用于少量样本的抽提。树脂抽提法和树脂-二氧化硅抽提法从提纯效果、成本等方面评价,较适用于大量样本抽提处理工作。异硫酸氰胍抽提法,抽提快,成本低但所用试剂对身体有毒害,较适用于大量样本或应急样本的处理。     

间接血凝试验在日本血吸虫病诊断中的价值研究

目的评价间接血凝试验(IHA)在日本血吸虫病诊断中的应用价值。方法在Medline、中国知网、维普、万方数据库中收集1982-2014年有关IHA诊断日本血吸虫病的相关研究文献,采用Meta分析法进行评价。结果有21篇符合要求的文献纳入本研究。在实验室评估中,IHA法检测日本血吸虫病AUCSROC=0.990 6;但在现场应用中,AUCSROC=0.832 9;两者差异有统计学意义(Z=4.50,P0.05)。结论 IHA在现场应用中的日本血吸虫病诊断价值低于在实验室评估中的诊断价值。在消除血吸虫病阶段,亟待开发现场应用价值高的诊断试剂。     

Application of molecular techniques in detection and quantification of helminthic infection in mollusc host

分子生物学技术是检测与定量分析的一种重要研究手段。本文对常用分子生物学方法的特性、敏感性、特异性、优缺点及其在蠕虫检测中的应用进行了综述。     

我国不同流行区婴儿利什曼原虫前鞭毛体比较蛋白质组学分析

目的 应用比较蛋白质组学方法分析两株来自我国内脏利什曼病不同流行区的婴儿利什曼原虫前鞭毛体蛋白表达差异,为筛选和鉴定我国不同流行区利什曼原虫致病差异相关分子奠定基础。方法 分别培养两株分离于我国四川九寨沟县（SC6株）和新疆伽师县内脏利什曼病流行区（JIASHI?5株）的婴儿利什曼原虫前鞭毛体,经酶解后进行液相色谱串联质谱（Liquid chromatography?tandem mass spectrometry, LC?MS/MS）非标记（Label?free）定量分析,利用MaxQuant软件（版本号1.3.0.5）查库,进行非标定量（Label?free quantitation,LFQ）分析。结果 成功鉴定蛋白4 274个,筛选出差异蛋白1 219个（差异倍数＞2.0 或 ＜0.5,P < 0.05）,其中JIASHI?5株前鞭毛体特有蛋白550个,SC6 株前鞭毛体特有蛋白174个。SC6 株和 JIASHI?5 株间差异表达蛋白495个,其中SC6株上调蛋白（高表达）167个,JIASHI?5株上调蛋白328个。这些差异表达蛋白主要涉及能量代谢、应激反应、延长感染宿主细胞的寿命以及利什曼原虫存活与增殖。结论　来自我国内脏利什曼病不同流行区的婴儿利什曼原虫前鞭毛体蛋白质表达存在差异。     

广西壮族自治区犬巴贝虫感染现状调查

目的 分析广西壮族自治区犬巴贝虫病的流行情况. 方法 在广西的玉林、北海、南宁、百色和河池等地区的17个采样点,用FTA试纸卡采集犬血.巢式PCR特异性扩增巴贝虫18s rDNA基因,纯化阳性样本的PCR产物、测序,与GenBank中的巴贝虫序列进行比对.应用Mega5.1软件构建系统发育树,分析系统发生关系. 结果 共采获87份犬血,其中阳性血样11份,感染率为12.64％ （11/87）.11份阳性血样的巴贝虫序列相同,与GenBank中的佛氏巴贝虫（Babesia canis vo-geli的同源性为98.1％.在邻接法构建的系统进化树上,犬血样中检测到的巴贝虫与佛氏巴贝虫同属一个分枝,系统发生关系近. 结论 广西犬血中检测到的巴贝虫与GenBank中的佛氏巴贝虫同源性高,为佛氏巴贝虫.