建立小鼠深静脉血栓模型的实验研究

目的建立小鼠深静脉血栓动物模型。方法采用下腔静脉结扎法制备动物模型,观察血管中血栓形成的病理变化并与假手术组比较。结果模型小鼠下腔静脉内形成稳定的血栓,且符合人体静脉血栓形成的病理特性。病理观察显示模型组静脉可见血栓并充满管腔,且与管壁无粘连,而假手术组静脉中无血栓形成。结论成功建立了小鼠深静脉血栓模型。     

ApoE^-/-；SAP—Tg小鼠模型的构建

目的为研究SAP蛋白在动脉粥样硬化中的作用及机制,拟构建ApoE^-/-;SAP—Tg小鼠模型。方法分别选取6～8周龄的雄性ApoE^-/-小鼠与血清淀粉样蛋白P转基因（SAP—Tg）6周龄的雌性小鼠杂交,得到的杂交后代以剪尾方式提取基因组DNA,用PCR法检测小鼠的基因型。结果雄性ApoE^-/-小鼠与雌性SAP-Tg小鼠杂交得F1代后自交,在F2代获得ApoE^-/-;SAP—Tg基因型小鼠,模型构建成功。结论将ApoE^-/-小鼠与SAP—Tg小鼠杂交2代后成功建立了ApoE^-/-;SAP—Tg小鼠模型,并可通过筛选出的F2代ApoE^-/-小鼠和ApoE^-/-;SAP—Tg小鼠交配进行繁育筛选工作。     

SphK1-S1P信号通路的激活参与糖尿病大鼠肾损伤的研究

目的观察鞘氨醇激酶1-1-磷酸鞘氨醇(SphK1-S1P)信号通路在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠肾脏中的激活情况。方法观察STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏中SphK1-S1P信号通路的激活情况。分别检测大鼠肾脏功能及病理指标。采用液质联用分析SphK1活性及S1P含量。并采用免疫组织化学、Real-time PCR和Western blot法检测了SphK1的表达。结果 STZ诱导的糖尿病大鼠血糖、肾重体质量比、24h尿蛋白显著升高,糖尿病大鼠肾脏系膜区肥大,细胞外基质扩展。同时,糖尿病大鼠肾脏中SphK1-S1P信号通路被激活,表现为SphK1表达和活性增加,以及S1P生成增加。结论糖尿病大鼠肾脏中存在SphK1-S1P信号通路的激活,可能参与了糖尿病大鼠肾损伤过程。     

SphK1突变抑制高糖培养的系膜细胞纤维连接蛋白过度表达的研究

目的研究鞘氨醇激酶-1（SphK1）突变是否抑制了高糖培养的系膜细胞中纤维连接蛋白（FN）的过度表达。方法采用Western blot检测FN的表达。结果系膜细胞转染了SphK1突变质粒后可消除高糖诱导的FN上调效应。结论本研究结果证明了SphK1在高糖诱导的系膜细胞FN表达过程中发挥着重要的调节作用。     

检测细胞中1-磷酸鞘氨醇含量的LC-MS/MS分析方法的建立

目的建立并确证可以检测1-磷酸鞘氨醇(S1P)快速、灵敏、特异的LC-MS/MS定量分析方法。方法采用C17-S1P作为内参,甲醇一步法进行蛋白沉淀,随后进行正相电喷雾离子化LC-MS/MS分析。流动相为甲醇-0.1%甲酸水(95∶5,v/v),流速0.2mL/min,每个样品的分析时间为4min。细胞经TNF-α处理后S1P含量显著增加;而经DMS处理后S1P含量显著下降。结果 S1P的标准曲线线性范围为0.1～10ng/mL。相关系数r2均大于0.989。结论该方法可以快速,灵敏,特异性地同时检测生物样品中S1P的含量。     

虎杖苷抑制肝星状细胞活化研究

目的：研究虎杖苷的抗肝纤维化药理作用。方法：采用转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激人肝星状细胞株（LX-2）诱导肝纤维化细胞模型,采用虎杖苷（20μM）进行干预。Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。结果：虎杖苷能显著抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞α-SMA的表达。结论：虎杖苷具有显著改善肝纤维化的作用,有望成为新型的抗肝纤维化药物。     

SphK1信号通路对高糖诱导的系膜细胞FN表达的影响

目的研究阻断鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SphK1)通路对高糖诱导的大鼠系膜细胞(glomerular mesangial cells,GMC)中纤维连接蛋白(fibronectin,FN)表达的抑制作用。方法采用RealtimePCR检测SphK mRNA水平;Western blot检测FN的蛋白表达。结果 SphK1抑制剂二甲基鞘氨醇(N,N-Dimethylsphingosine,DMS)显著降低高糖诱导的FN表达;转染SphK1 siRNA可有效消除高糖诱导的FN上调效应。结论 SphK1通路在高糖诱导的肾小球系膜细胞FN表达过程中发挥着重要的调节作用。     

检测生物样品中SphK1活性的LC-MS/MS分析方法的建立

目的建立并确证一种快速、灵敏、高效的测定生物样品中SphK1活性的液质联用（LC-MS/MS）分析方法。方法采用C17-Sph作为底物,通过测定产物C17-S1P的生成量来评价SphK1的活性进行体外酶促反应。终止反应后,生物样品经液-液萃取,真空干燥,复溶,进行LC-MS/MS分析。通过测定产物C17-S1P的生成量来评价SphK1的活性。结果 C17-S1P标准曲线的线性范围为10～1 000 ng mL-1,相关系数r2〉0.998,最低检测限（LLOQ）为10 ng mL-1。HEK293细胞转染了野生型SphK（SphKWT）后,SphK1活性显著增加。相反HEK293细胞转染了突变型SphK（SphKG82D）后,SphK1活性接近正常水平。结论该方法能够灵敏快速地测量SphK1活性,为研究SphK1信号通路及其相应靶标药物提供了有效的分析手段。