溴化1-甲基-1-苄基-4-(((三苯基锡基)硫)硫代甲酰基)哌嗪-1-铵的活性测定

目的测定硫代甲酸盐有机锡类成盐化合物溴化1-甲基-1-苄基-4-(((三苯基锡基)硫)硫代甲酰基)哌嗪-1-铵对小鼠的半数致死量(median lethal dose,LD50)、对小鼠体液免疫功能的影响及其抗菌活性。方法急性毒性试验检测LD50,溶血素测定法测定体液免疫功能,纸片扩散法、倍比稀释法检测其抗菌活性。结果以小鼠急性死亡率为指标,测得LD50为93.7 mg/kg,可信限为(100.98±8.66)mg/kg,可信限率为8.58%,小于10%,表明实验方法准确度高,数据可靠性高;溶血素测定结果表明:与对照组相比,低、中、高3个剂量组的半数溶血值(half value of hemolysin,HC50)显著较高(P<0.01),差异有统计学意义,与阴性对照组相比,空白对照组及3个剂量组均较高(P<0.01),差异有统计学意义,表明此药有提高体液免疫的效果;抗菌活性测定结果表明此药对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和伤寒杆菌均显示抑菌作用,其中对伤寒杆菌抑制效果最好,其最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC值)为0.31 mg/m L。结论溴化1-甲基-1-苄基-4-(((三苯基锡基)硫)硫代甲酰基)哌嗪-1-铵为中度毒性药物,有体液免疫调节作用,且随剂量增加作用降低,对所测菌株具有抗菌活性。     

水杨醛缩氨基脲含硅有机锡化合物的合成和抑菌活性测试

目的 合成新型的含硅有机锡化合物,并进行抑菌活性测试。方法 利用4种水杨醛缩氨基脲配体与(Me₃SiCH₂)₂SnCl₂通过常温下的自组装反应合成了4种新型含硅有机锡化合物,利用红外光谱、核磁共振以及X-射线单晶衍射对所得产物的结构进行表征,通过纸片扩散法测试产物的抑菌活性。结果 在化合物1~4中,水杨醛缩氨基脲配体均呈现三齿配体形式与锡原子螯合配位,中心锡原子呈五配位的三角双锥结构。抑菌实验发现3种新合成的水杨醛缩氨基脲含硅有机锡化合物对G⁺菌包括金黄色葡萄球菌、G⁺蜡样芽孢杆菌和真菌蜡蚧轮枝孢菌显示抑菌作用。化合物3对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为20 mm,最低抑菌浓度为25.17 mol·L^-1。此类化合物对G^-菌包括大肠杆菌、伤寒杆菌、产气肠杆菌无明显抑制作用。结论 水杨醛缩氨基脲含硅有机锡化合物对G⁺菌包括金黄色葡萄球菌及真菌蜡蚧轮枝孢菌具有一定的抑菌活性,对G^-菌无明显的抑制作用。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂衍生物在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达重组人组织型纤溶酶原激活剂衍生物(rPAm),并检测rPAm的活性。方法用PCR从质粒pLFrGGI上扩增出目的蛋白(rPAm)基因,再亚克隆到酵母表达载体pMEX9K中,转化到宿主菌GS115,菌落PCR鉴定转化子,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定表达产物,再通过层析法纯化目的蛋白,用溶圈法测定目的蛋白的活性。结果表达的重组蛋白分子量约为50kD。纯化后的目的蛋白的纯度可达到95%。Western-blot显示能与抗tPA抗体特异性结合,纯化后rPAm比活性为5.02×105IU/mg,比活性与t-PA相当。结论成功构建了rPAm酵母表达工程菌,建立了对目的蛋白的纯化方法。     

抗凝血酶受体单克隆抗体的制备与鉴定

采用杂交瘤技术，获得了４株稳定分泌抗凝血酶受体单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞株。４株ＭｃＡｂ均为ＩｇＧ１κ链。ＥＬＩＳＡ交叉试验结果表明，该ＭｃＡｂ不与人凝血酶、凝血酶原和ＨＣＶ多肽反应。４株杂交瘤细胞培养上清液效价为３．２×１０－２～１．２８×１０－３，腹水效价为１．６×１０－６～５．１２×１０－７。     

抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达

目的：表达具有中和活性的抗基孔肯亚病毒人．鼠嵌舍抗体。方法：用RT-PCR法克隆具有中和活性的抗基孔肯亚病毒鼠源单克隆抗体CHIK-IF1的轻重链可变区基因，克隆人IgG1恒定区基因组基因，构建了轻重链嵌舍基因和表达质粒pCdhfrlL，pcDNA3、1H，共转染二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞，用ELISA检测培养上清中嵌舍抗体的表达，MTX加压筛选表达量高的克隆，扩大培养收集上清并纯化，纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western印迹检测和抗原结合活性的检测。结果与结论：在CHO细胞中成功表达了抗基孔肯亚病毒的嵌舍抗体，为制备抗基孔肯亚病的被动免疫制剂奠定了良好的基础。     

抗前列腺干细胞抗原鼠单克隆抗体的制备及其初步鉴定

目的:制备抗前列腺干细胞抗原鼠单克隆抗体(mAb).方法:采用杂交瘤技术,获得了10余株针对前列腺干细胞抗原(PSCA)的鼠mAb杂交瘤细胞株,对其中的6株进行了相关鉴定.结果:6株mAb的腹水效价均达到 1: 512 000,将其中的两株mAb进行了纯化,纯化后纯度大于90%,抗体亚类(型)mAb1、 mAb26为 IgG2b/k型,mAb6、 mAb11、 mAb37 为IgG1/k型,mAb46为 IgG2a/k型;ELISA结果显示制备的mAb与PSCA可发生特异反应.结论:制备了抗前列腺干细胞抗原鼠mAb,为PSCA生物学功能的研究打下基础.     

利用穿梭质粒快速构建含抗HAV Fab基因的重组杆状病毒

采用Bac-to-Bac系统,分别将Fd、轻链连同其信号肽基因克隆于pFastBac Dual不同启动子下,转化DH10Bac后,快捷方便地获得重组病毒,并且在sf9细胞中表达出具有HAV抗原结合活性的Fab。 1.材料和方法:(1)质粒、细胞株:pBSFdS:含重链及其信号序列基因的质粒,pBSLS:含轻链及其信号序列基因的质粒,由本室构建;pFastBac Dual质粒购自美国Gibco公司。草地贪夜蛾细胞(sf9),购自美国Invitrogen公司。(2)重组Bacmid的筛选:重组转座载体pFBFab转化DH10Bac,涂布于X-gal和IPTG的平板,挑选较大的白色菌落,提取质粒,即为重组的Bacmid。(3)转染sf9细胞:用Lipofectamine Plus转染,27℃培养过夜,次日换液,继续培养72h。收集上清液,500×g离心10min,将上清液分成小份作病毒原种。(4)重组蛋白的表达及检测:每瓶加入含适量重组杆状病毒毒种的完全培养基2ml,加入     

杀菌蛋白DNA改组的初步研究

目的：运用DNA家族改组方法提高杀菌蛋白（BPI23）的杀菌活性。方法：首先将人、猴、兔BPI23基因的PCR产物等量混合，用DNAase I消化，回收50bp左右的片段，再经无引物和有引物2步PCR反应获得与原基因大小相同的改组分子，将其与载体连接获得改组文库。应用Flp-In^TM定点整合表达系统，将BPI23改组文库插入CHO细胞基因组中1个单拷贝位点，分别检测各个细胞克隆的杀菌活性，从中筛选高活性的BPI23改组分子。结果：经过2轮改组和筛选，共获得4个活性高于人BPI23约4倍的克隆，它们与人BPI23基因有7－13个氨基酸的变化。结论：探索了CHO系统中进行DNA改组和筛选的方法与技术路线，成功进行了杀菌蛋白的改组，并为其它分子的改组提供了借鉴。     

炭疽毒素保护性抗原和LFn介导的增强型绿色荧光蛋白进入HeLa细胞的研究

目的 研究炭疽毒素保护性抗原(protective antigen,PA)和致死因子(lethal factor,LF)N端254个氨基酸(LFn)在辅助增强型绿包荧光蛋白(EGFP)进入细胞中的作用.方法 分别扩增炭疽毒素的基因片段和EGFP的基因全长,将两片段先后克隆至pET-21a(+),构建成重组表达质粒pET-LFn-EGFP,在大肠杆菌中诱导表达,并对融合蛋白LFn-EGFP进行纯化.利用荧光共聚焦显微镜和流式细胞术研究LFn-EGFP融合蛋白进入细胞的情况.结果 获得较高纯度的融合蛋白LFn-EGFP,纯度可达90%以上,体外实验显示该融合蛋白保留了LFn与PA结合的活性,并且能够进入到HeLa细胞中.结论 LFn-EGFP蛋白本身也会以未知的机制进入细胞,在PA辅助时,LFn-EGFP进入细胞的效率会有所增加.