骨髓神经组织定向干细胞的分离培养鉴定

目的:为临床中枢神经系统疾患的细胞移植及组织工程修复周围神经提供一种应用广泛、可来源于自体、无免疫排斥和伦理道德等问题的移植用种子细胞。方法:采用DMEM/F12(1∶1)无血清神经干细胞培养液,通过先贴壁、后悬浮的方法从大鼠骨髓中分离、培养单克隆生长的神经组织定向干细胞(neural tissue-committed stem cells,NTC-SCs),通过免疫细胞化学检测NTCSCs细胞球CXCR4和Nestin蛋白,以及细胞球自然分化后神经元β-TublinⅢ、MAP2ab以及神经胶质细胞CNPase、GFAP等蛋白的表达。结果:NTCSCs细胞球表达神经干细胞标志蛋白Nestin和组织定向干细胞标志蛋白CXCR4;NTCSCs细胞球在含15%胎牛血清的DMEM培养液中可自然分化,免疫荧光显示神经元和神经胶质蛋白β-TublinⅢ、MAP2ab、CNPase、GFAP等标志物阳性。结论:本研究提供了一种操作简便、成本低廉的NTCSCs的分离培养方法,NTCSCs作为种子细胞为脑、脊髓等神经系统疾患和创伤的修复和治疗提供了广阔的应用前景。     

骨髓神经组织定向干细胞性组织工程化神经移植修复坐骨神经损伤

目的:为临床周围神经损伤的组织工程化神经替代治疗提供可靠的实验依据。方法:采用体外成功构建的骨髓神经组织定向干细胞(NTCSCs)组织工程化神经,桥接缺损10mm的大鼠坐骨神经。通过术后行为学、神经功能指数分析(SFI)、神经电生理功能检查和HRP逆行追踪,以及对移植至支架的标记细胞在体内的存活、增殖及分化的形态学观察,综合评价损伤神经的功能恢复情况。结果:(1)SFI及神经电生理功能检查显示,NTCSCs组织工程化神经移植能明显促进神经传导功能及运动功能的恢复。(2)HRP逆行追踪结果显示NTCSCs组织工程化神经移植能明显促进神经纤维再生。(3)免疫荧光双标结果显示移植到体内的NTCSCs,从4周到12周,其细胞数显著增加,体内的NTCSCs细胞能分化成少量NSE阳性细胞,但大部分分化成S-100阳性细胞。结论:该骨髓神经组织定向干细胞性组织工程化神经能够有效的促进损伤坐骨神经的功能恢复。     

骨髓神经组织定向干细胞化组织工程神经桥接坐骨神经缺损

BACKGROUND： Schwann cells are the most commonly used cells for tissue-engineered nerves. However, autologous Schwann cells are of limited use in a clinical context, and allogeneic Schwann cells induce immunological rejections. Cells that do not induce immunological rejections and that are relatively easy to acquire are urgently needed for transplantation. OBJECTIVE： To bridge sciatic nerve defects using tissue engineered nerves constructed with neural tissue-committed stem cells （NTCSCs） derived from bone marrow; to observe morphology and function of rat nerves following bridging; to determine the effect of autologous nerve transplantation, which serves as the gold standard for evaluating efficacy of tissue-engineered nerves. DESIGN, TIME AND SETTING： This randomized, controlled, animal experiment was performed in the Anatomical Laboratory and Biomedical Institute of the Second Military Medical University of Chinese PLA between September 2004 and April 2006. MATERIALS： Five Sprague Dawley rats, aged 1 month and weighing 100-150 g, were used for cell culture. Sixty Sprague Dawley rats aged 3 months and weighing 220-250 g, were used to establish neurological defect models. Nestin, neuron-specific enolase （NSE）, glial fibrillary acidic protein （GFAP）, and S-100 antibodies were provided by Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA. Acellular nerve grafts were derived from dogs. METHODS： All rats, each with 1-cm gap created in the right sciatic nerve, were randomly assigned to three groups. Each group comprised 20 rats. Autograft nerve transplantation group： the severed 1-cm length nerve segment was reverted, but with the two ends exchanged; the proximal segment was sutured to the distal sciatic nerve stump and the distal segment to the proximal stump. Blank nerve scaffold transplantation group： a 1-cm length acellular nerve graft was used to bridge the sciatic nerve gap. NTCSC engineered nerve transplantation group： a 1-cm length acellular nerve graft, in which NTCSCs were inoculated, was used to bridge the sciatic nerve gap. MAIN OUTCOME MEASURES： Following surgery, sciatic nerve functional index and electrophysiology functions were evaluated for nerve conduction function, including conduction latency, conduction velocity, and action potential peak. Horseradish peroxidase （HRP, 20%） was injected into the gastrocnemius muscle to retrogradely label the 1-4 and L5 nerve ganglions, as well as neurons in the anterior horn of the spinal cord, in the three groups. Positive expression of nestin, NSE, GFAP, and S-100 were determined using an immunofluorescence double-labeling method. RESULTS： NTCSCs differentiated into neuronal-like cells and glial-like cells within 12 weeks after NTCSC engineered nerve transplantation. HRP retrograde tracing displayed a large amount of HRP-labeled neurons in I-45 nerve ganglions, as well as the anterior horn of the spinal cord, in both the autograft nerve transplantation and the NTCSC engineered nerve transplantation groups. However, few HRP-labeled neurons were detected in the blank nerve scaffold transplantation group. Nerve bridges in the autograft nerve transplantation and NTCSC engineered nerve transplantation groups exhibited similar morphology to normal nerves. Neither fractures or broken nerve bridges nor neuromas were found after bridging the sciatic nerve gap with NTCSCs-inoculated acellular nerve graft, indicating repair. Conduction latency, action potential, and conduction velocity in the NTCSC engineered nerve transplantation group were identical to the autograft nerve transplantation group （P 〉 0.05）, but significantly different from the blank nerve scaffold transplantation group （P 〈 0.05）. CONCLUSION＂ NTCSC tissue-engineered nerves were able to repair injured nerves and facilitated restoration of nerve conduction function, similar to autograft nerve transplantation. ＂     

骨髓中一类新细胞群——神经组织定向干细胞的确立☆

背景：骨髓间充质干细胞和造血干细胞具有分化为神经类细胞的潜能已得到共识。另有研究者认为骨髓中除骨髓间充质干细胞和造血干细胞以外，还寄居着CXCR4阳性的组织定向干细胞，包括骨骼肌、心、肝及神经组织定向干细胞。 目的：实验拟进一步证实神经组织定向干细胞寄居于骨髓，并寻求确立神经组织定向干细胞分离、培养的新方法。 设计：开放性实验。 单位：解放军第二军医大学解剖学教研室。 材料：所用成年清洁级SD大鼠由解放军第二军医大学动物中心提供。DMEM/F12，B27，N2均购自Invitrogen公司；bFGF源于CytoLab Ltd；EGF源于Invitrogen公司；Nestin、CXCR4，β-Tublin Ⅲ，神经胶质纤维酸性蛋白等一抗为Santa Cruz公司兔抗鼠多克隆抗体；MAP2ab（Clone11-5B），CNPase（Clone AP20）为NeoMarkers公司小鼠抗大鼠单克隆抗体；荧光（FITC，Cy3）标记试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化试剂盒购自Vector Laboratories公司。NycoPrepTM分离液（1.077A）购自Axis-Shield 公司。 方法：实验于2004-01/2006-12在解放军第二军医大学组织工程研究所完成。取SD大鼠双侧股骨及胫骨，冲洗骨髓腔，经NycoPrepTM分离液分离单核细胞层，DMEM/F12（1∶1） 无血清神经干细胞培养液（内含2%B27，1%N2，20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子， 20 μg/L 表皮生长因子,1×105 U/L青霉素, 100 mg/L链霉素），通过先贴壁、后悬浮的方法从骨髓中分离、培养单克隆生长的神经组织定向干细胞。 主要观察指标：通过免疫细胞化学法检测神经组织定向干细胞细胞球CXCR4和nestin蛋白，以及细胞球自然分化后神经元以及神经胶质细胞的标志蛋白。 结果：①神经组织定向干细胞细胞球表达神经干细胞标志蛋白nestin和组织定向干细胞标志蛋白 CXCR4。②神经组织定向干细胞细胞球在含15%胎牛血清的DMEM培养液中可自然分化，分化细胞呈梭形或多角形，有2~5个细胞突起，免疫荧光检测显示神经元标志蛋白β-tublinIII及MAP2ab，以及神经胶质标志蛋白CNPase和神经胶质纤维酸性蛋白阳性。 结论：骨髓中存在神经组织定向干细胞，可自然分化为神经元样细胞及神经胶质样细胞。     

督脉电针上调脊髓损伤早期大鼠Bcl-2 mRNA及蛋白的表达

背景：针灸对脊髓损伤后期神经功能的恢复具有明显的促进作用已得到客观证实，本课题组以往的实验已证实电针可抑制脊髓损伤早期细胞凋亡，但电针抑制细胞凋亡的机制尚不清楚。目的：通过原位杂交及免疫组织化学方法观察电针对凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA及蛋白表达的影响，探讨电针干预脊髓损伤早期细胞调亡可能的机制。设计：开放性动物实验。单位：解放军第二军医大学解剖学教研室，上海市针灸经络研究中心。材料：成年雄性SD大鼠，清洁级，鼠龄两三个月。Bcl-2原位杂交检测试剂盒（武汉博士德生物科技有限公司）；Bcl-2抗体（1：200，Santa Cruz Biotechnology公司）。方法：实验于2004—07／2005—12在解放军第二军医大学解剖学教研室完成。实验大鼠随机分为模型组、电针治疗组、甲基强的松龙组及假手术组。采用改良的Allen’s垂击法致大鼠T10脊髓损伤，损伤后即刻进行督脉电针治疗，应用原位杂交和免疫组织化学方法结合图象定量分析法进行评估。主要观察指标：①脊髓损伤早期Bcl-2 mRNA和蛋白的表达。②电针对Bcl-2 mRNA和蛋白表达的影响结果：实验过程中如遇动物死亡，及时补充，最终42只大鼠进入结果分析。①假手术组有中等量的Bcl-2 mRNA及蛋白表达。模型组在脊髓损伤后6hBcl-2 mRNA表达有增高趋势，Bcl-2蛋白表达未见明显变化；伤后24hBcl-2 mRNA表达增高，Bcl-2蛋白表达也相应增高。电针组Bcl-2 mRNA及蛋白表达均高于模型组（P〈0．05），与甲基强的松龙组相比无显著性差异。②电针及甲基强的松龙治疗6h组，Bcl-2 mRNA阳性细胞数增加，灰度值降低，与假手术组和模型组相比差异有显著性和非常显著性意义（P〈0．05-0．01）。电针24h治疗组，Bcl-2 mRNA阳性细胞数显著增高，灰度值降低，与假手术组及模型组相比差异均具有显著性和非常显著性意义俨〈0．05-0．01）。⑧电针24h治疗组，Bcl-2免疫阳性细胞明显增加，灰度值降低，与假手术组和模型组相比，差异具有显著性和非常显著性意义俨〈0．05-0．01）。结论：电针可上调Bcl-2 mRNA及蛋白的表达，进而对脊髓损伤早期细胞调亡具有部分抑制作用。     

大鼠后三里针刺前后细胞外基质的差异性基因表达

目的:探讨穴位区针刺前后细胞外基质的差异性基因表达及其在针刺信号转导中的作用机制。方法:SD大鼠10只,分针刺组和针刺对照组2组,手法针刺大鼠“后三里”30 min,立即取材;针刺对照组也取左侧后三里相应区域的组织。所取组织经RNA提取及纯化后,采用Agilent大鼠cDNA芯片比较2组大鼠细胞外基质的差异性基因表达,对差异性表达的基因进一步采用实时定量PCR法验证。结果:大鼠后三里区针刺前后细胞外基质具有差异性表达的基因有4条,针刺前后的整合素无差异性基因表达。结论:针刺前后穴位区细胞外基质存在部分差异性表达基因,细胞外基质在针刺始动中的具体作用途径及机制还有待进一步研究。     

骨髓基质干细胞移植在脊髓损伤中的应用

1．概述 脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统的创伤性疾病，病情严重的患者往往面临终生瘫痪。只有损伤较轻的患者才有机会恢复脊髓功能，多数患者的治疗效果很不理想，患者失去损伤节段以下的运动和感觉能力，严重影响患者的生活质量，给家庭和社会带来沉重负担。近年来细胞移植成为脊髓损伤治疗的研究热点，尤其是骨髓基质干细胞能够取材于成人自身的骨髓，避免了胚胎干细胞和神经干细胞所带来的伦理学和免疫排斥问题，并且容易增殖，这些优点使得骨髓基质干细胞成为极有前景的移植材料。     

骨髓神经组织定向干细胞性组织工程化神经的构建

目的:为临床周围神经损伤的移植治疗提供生物化的神经移植替代物.方法:将骨髓神经组织定向干细胞(NTCSCs)种植于犬坐骨神经脱细胞神经支架,构建组织工程化神经,桥接缺损的大鼠坐骨神经,检测所构建生物化组织工程神经中骨髓NTCSCs的增殖、分化及神经性基因表达,观察该神经移植到体内后的细胞增殖、分化及对神经缺损功能的修复.结果:由骨髓NTCSCs和异种脱细胞神经支架构建的生物化组织工程神经物理性状相似于神经移植体,骨髓NTCSCs在支架上增殖、迁移,并表达神经性基因及蛋白.该组织工程神经植入体内后,骨髓NTCSCs分化为少量神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞及大量S-100阳性细胞,并可修复缺损的坐骨神经功能.结论:骨髓NTCSCs和异种脱细胞神经支架构建的生物化组织工程神经相似于神经移植体,可应用于周围神经损伤修复中.     

Role of Extracellular Matrix in Acupoint Region in Acupuncture Effect

目的：探讨穴区细胞外基质在针刺信号转导中的作用机制。方法：SD大鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，每组10只，以大鼠热辐射甩尾实验的温度变化为观察指标。实验组大鼠“后三里”区注射人工合成的五肽甘氨酰-精氨酰-甘氨酰-天冬酰-酪氨酸（Gly—Arg-Gly-Asp-Tyr,GRGDY）30min后再针刺，以大鼠基础痛阈组、“后三里”区注射0．9％NaCl组及针刺后三里组为对照。结果：GRGDY注射后30min再针刺，大鼠甩尾的温度与针刺组相比未见明显改变。结论：GRGDY未能阻断针刺效应，针刺效应的初始机制可能与细胞外基质与整合素特异性的结合位点RGD无关。     

穴位区细胞外基质在针刺始动中的作用

目的探讨穴位区细胞外基质在针刺信号转导中的作用机制。方法SD大鼠40只,雌雄各半,随机分为4组,每组10只,以大鼠热辐射甩尾实验的温度变化为观察指标。实验组大鼠“后三里”区注射人工合成的五肽甘氨酰-精氨酰-甘氨酰-天冬酰-酪氨酸GRGDY（Gly—Arg—Gly—AsP—Tyr）30min后再针刺,以大鼠基础痛阈组、“后三里”区注射0．9％NaCl组及针刺后三里组为对照。结果GRGDY注射后30min再针刺,大鼠甩尾的温度与针刺组相比未见明显改变。结论GRGDY未能阻断针刺效应,针刺效应的初始机制可能与细胞外基质与整合素特异性的结合位点RGD无关。