血管内皮生长因子在高原脑水肿形成中作用的实验研究

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)在高原脑水肿形成中的作用。方法:建立大鼠模拟高原模型,应用脑干湿重比率法定量脑水肿情况、应用荧光素钠透过率测定BBB通透性、应用实时荧光定量RT-PCR法检测脑组织VEGF mRNA含量以及应用蛋白印迹法半定量脑组织VEGF含量。结果:大鼠在高原24 h后脑组织含水率明显增高(P<0.05),荧光素钠透过率显著增加(P<0.01);VEGF mRNA转录及其表达显著增高(P<0.001)。结论:VEGF表达在高原脑水肿形成中起重要作用。     

人肺癌细胞转录因子--C/EBP和HMG样蛋白的EMSA检测

目的：检测人肺癌细胞中是否存在与Na^ /H^ 交换蛋白-1（NHE-1）基因转录相关的重要转录因子--C/EBP和HMG样蛋白。方法：采用电泳迁移率改变分析法（EMSA）检测人肺癌细胞株核蛋白中C/EBP和HMG样蛋白的表达及其水平。结果：EMSA检测到A549细胞和转染NHE-1反义载体的A549细胞均有转录因子C/EBP和HMG样蛋白的表达，且后者表达水平高于前者；采用50倍未标记的片段能完全抑制相应转录因子与^32P标记的相同片段的结合。结论：A549细胞核蛋白中存在能与C/EBP结合序列和Poly(dA：dT)区结合的转录因子，即C/EBP和HMG样蛋白，后者的表达水平高于前者。特异性竞争抑制试验表明外源性特异DNA片段能抑制相同片段与转录因子的结合。     

人肺癌细胞NHE-1基因部分正调控序列的克隆

目的 克隆人肺癌细胞Na∧ /H∧ 交换泵-1（NHE-1）基因上游正调控序列部分,为进一步将该片段导入肺癌细胞株,竞争性结合转录因子,达到抑制细胞内NHE-1基因的表达奠定基础。方法 采用PCR技术从人肺癌A549细胞基因组中扩增长约170bp的NHE-1基因调控序列中起正调控作用的片段。在上、下游引物的5′-端带上BanHI和EcoRI酶切位点。然后将该片段连接到pUC18载体上,最后对产生的重组子进行酶切、PCR和测序鉴定。结果 经酶切及PCR鉴定,所克隆的目的片段大约为180bp,而NDA测序证实克隆并插入到载体中的片段为目的的片段,长度为168bp,与报道的序列比较缺失2个t。结论 本实验已成功地克隆了人肺癌细胞NHE-1基因调控序列中正调控序列片段。     

血管能抑素重组基因表达载体抗肺癌效应研究

目的:通过构建人血管能抑制素(Canstatin)真核表达载体,转染裸鼠肿瘤局部,探索其对肺癌治疗作用.方法:RT-PCR法获取Canstatin cDNA全长,定向克隆法构建Canstatin基因表达载体pCMV-Script-Cans.荧光定量PCR法检测转染细胞Canstatin mRNA的表达.台盼蓝拒染法、3H-TdR掺入法检测细胞生长增殖,TUNEL法检测细胞凋亡.基因枪转染重组载体到荷瘤裸鼠肿瘤局部,CD31单克隆抗体微血管记数检测抗血管生成效应.结果:成功构建pCMV-Script-Cans重组载体,并在转染的细胞株中检测到Canstatin mRNA的表达.人脐静脉内皮HUV-EC-C细胞株pCMV-Script-Cans质粒转染组比空载体组3H-TdR掺入量明显减低(P＜0.01),细胞凋亡率明显增加(P＜0.01),重组载体转染肿瘤生长缓慢,微血管数显著低于对照组(P＜0.01).结论:pCMV-Script-Cans重组载体能在转染的哺乳动物细胞中表达Canstatin,并抑制内皮细胞增殖,而且有很好的抗肺癌血管生成作用.     

NHE-1基因的反义核酸对人肺癌细胞的酸化作用及其意义

目的探讨Na~ ／H~ 交换系-1（NHE-1）基因在肿瘤细胞内pH（pHi）调节及细胞增殖／死亡中的作用,方法采用荧光探针法检测与NHE-1基因的反义核酸片段（AS-ODN）共孵育后PLA-801D细胞的PHi;用活细胞计数法观察AS-ODN对PLA-801D细胞的毒性作用.结果发现20uMAS-ODN处理24至48小时后即能明显酸化PLA-801D细胞（P＜0.01）,且能显著抑制肿瘤细胞的增殖并导致其死亡。结论NHE-1基因的表达在肿瘤细胞pHi调节及增殖／死亡的调控中起重要作用,抑制其超表达和NHE-1活性有一定的应用价值.     

Canstatin分泌增强体系的建立及其抗肺癌作用

目的:评估canstatin分泌增强体系在不同氧条件下的生物学效应,观察其对裸鼠肺癌模型的抗肿瘤作用。方法:基因重组技术构建canstatin分泌型载体,将其转染肿瘤细胞观察其在不同氧条件下的canstatin mRNA表达量,稳定转染的肺癌细胞与人脐静脉内皮细胞混合培养,观察混合培养对内皮细胞增殖、凋亡的效应。建立裸鼠肺癌移植瘤模型,将此体系转染荷瘤裸鼠,观察其对裸鼠移植瘤血管生成的作用,及肿瘤体积重量等指标,评估其抗肺癌效果。结果:成功构建canstatin缺氧增强分泌体系。缺氧条件下其转染的肺腺癌A549细胞canstatin mR-NA的表达显著增加。其稳定转染的A549细胞与人脐静脉内皮细胞HUVEC混合培养可使HUVEC生长增殖缓慢并大量凋亡,此体系转染的裸鼠移植瘤生长缓慢,瘤重、瘤体积及血管生成均显著低于对照组。(P<0.01)。结论:canstatin分泌增强体系在缺氧条件下能显著增加目的基因表达量及其生物学效应,并具有显著抑制肺癌生长和血管生成的作用。     

canstatin基因转染对肺癌A549细胞和血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

背景与目的　肿瘤的生长和转移需要大量新血管的生成,人血管能抑素(canstatin)是新近发现的高效内源性血管生成抑制剂,其抑制血管内皮细胞的作用已引起人们广泛关注。本研究的目的是探讨can statin基因在人肺癌A549细胞和人脐静脉内皮细胞HUV ECC中的表达及意义。方法　将canstatin基因通过电穿孔的方法转染人肺癌细胞A549和人脐静脉内皮细胞HUV ECC,行G418筛选获得转基因细胞克隆。用SDS PAGE电泳检测canstatin蛋白在转基因细胞培养上清液中的表达,以流式细胞仪分析细胞周期,并比较转基因和未转基因细胞的生长特性。结果　canstatin在转染组A549 细胞和ECC细胞表达并分泌至上清液中。canstatin基因转染组ECC的凋亡率(16.04%)显著高于空载体组(0.43%)和亲代细胞组(2.92%)(P<0.01),转染细胞生长明显受抑(P<0.01)。而转染组A549细胞的凋亡率(0.19%)与空载体组(0.13%)及亲代细胞组(0.07%)比较无显著性差异(P>0.05),细胞生长也未受明显影响。结论　canstatin能特异地抑制内皮细胞增殖,并诱导内皮细胞凋亡。     

耐药肺腺癌细胞株A549/CDDP生物学特性及染色体核型分析

目的 建立氯氨顺铂诱导肺腺癌耐药细胞株A549／CDDP。分析A549／CDDP生物学特性及染色体核型，为肺腺癌的治疗提供实验依据。方法 采用氯氨顺铂（Cis—diaminodichloroplatin，CDDP）大剂量冲击加逐步诱导法建立肺腺癌耐药细胞株A549／CDDP，MTT法检测细胞耐药指数．生物发光法测定细胞能量代谢，流式细胞仪测试细胞周期，染色体G显带技术和光谱核型分析（spectral karyotyping，SKY）技术分析染色体变化。结果 MTT检测结果表明。A549／CDDP对7种不同的化疗药物表现了不同的耐药性，其ATP、ADP、AMP含量显著降低，细胞周期无明显变化。G显带结果表明A549／CDDP染色体为亚三倍体，SKY分析出现数条衍生染色体。结论 CDDP可以成功诱导肺腺癌耐药细胞株A549／CDDP，A549／CDDP衍生染色体可能与肺腺癌耐药有关。     

人β防御素-2基因在SPC细胞中的转染表达

目的合成人β防御素-2(hum anβ-defensin-2,hBD-2)基因并构建其真核表达载体,转染SPC细胞,检测其表达,明确hBD-2重组载体的表达活性,为hBD-2基因转染和表达的研究奠定基础。方法根据Genebank中的hBD-2结构基因序列设计合成三条引物,用PCR延伸扩增的方法合成hBD-2基因,克隆入真核表达载体pLXSN;通过脂质体转染法将pLXSN-hBD-2导入SPC细胞,采用W estern-b lot法检测hBD-2的表达。结果经凝胶电泳及测序分析,证实合成的基因与原序列一致,并成功克隆到真核表达载体pLXSN上,所构建的真核表达重组载体pLX-SN-hBD-2转染SPC细胞后呈现有效表达。结论成功构建了PCR合成的hBD-2基因真核表达重组载体pLXSN-hBD-2,通过基因转染的方法导入SPC细胞并获得表达hBD-2,为进一步的动物转基因抗感染实验研究提供了依据。     

重组人源MPG基因真核表达载体构建及转染非小细胞肺癌多药耐药细胞的研究

目的构建人N甲基化嘌呤DNA糖基化酶(NmethylpurineDNAglycosylase,MPG)基因真核表达载体,并研究其在稳定转染的人非小细胞肺癌多药耐药细胞中的表达情况。方法应用分子克隆技术构建pCMVScript/MPG重组真核表达载体;应用脂质体介导的基因转染技术将其导入人非小细胞肺癌多药耐药细胞株A549/CDDP内;应用G418筛选稳定表达的转染细胞;应用PCR检测pCMVScript载体上的NEOr基因,应用RTPCR及Westernblot检测MPG基因的表达。结果构建产物经限制性酶切分析及基因序列测定证实为pCMVScript/MPG重组表达载体;转染pCMVScript/MPG载体组(MP组)及转染pCMVScript载体组(P组)细胞内检测到NEOr基因,未转染组(C组)则未检测到;MP组细胞内MPGmRNA水平较P组及C组细胞显著增高(P<0.01);MP组细胞内MPG蛋白质水平较P组及C组细胞显著增高(P<0.01)。结论成功地构建了人MPG基因表达载体,并在人非小细胞肺癌多药耐药细胞A549/CDDP获得了稳定、高效的表达。