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目的:分别构建含有樱桃红荧光蛋白和蓝色荧光蛋白(BFP)标签的应激蛋白G3BP表达质粒,实现活细胞内G3BP蛋白的红/蓝色荧光标记。方法:以重组质粒pEGFP-C1-G3BP为模板,PCR法扩增出目的基因,分别利用EcoRI和BamHI双酶切法将目的片段连接到pmCheery-C1和pEBFP-N1载体上,再将构建成功的pmCheery-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP重组质粒转染入HeLa细胞内,以激光共聚焦显微镜及Western印迹法检测红/蓝色荧光蛋白与目的蛋白G3BP的融合表达以及在活细胞内的共定位情况。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜及Western印迹结果均检测到红/蓝色融合蛋白的表达,共定位分析结果显示两者均可在HeLa细胞胞浆中形成应激颗粒。结论:pmCheery-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP构建成功,对G3BP蛋白的红/蓝色荧光标记有助于进行其在细胞应激方面的机制研究。 相似文献
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目的:研究人类Tudor-SN蛋白TSN结构域4个亚片段的功能,构建重组质粒pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。方法:以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增出目的基因,将双酶切后带有粘性末端的目的片段和pEGFP-C2载体连接,从而构建重组质粒pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。将构建成功的重组质粒用脂质体法转染HeLa细胞,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况,Western印迹检测融合蛋白的表达。结果:对重组质粒进行双酶切鉴定可见Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)的cDNA片段;脂质体转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。Western印迹后可在相应位置检测到融合蛋白pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。结论:真核pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)重组质粒构建及表达成功。 相似文献
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目的:将人类Tudor-SN蛋白SN(1~4)基因片段分别定向连入pERFP-C1质粒,使Tudor-SN蛋白SN各功能片段与红色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pERFP-C1载体上,再将构建成功的pERFP-C1-Tudor-SN-SN(1~4)重组质粒转染入HeLa细胞内,在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜下观察到红色融合蛋白的表达。结论:重组pERFP-C1-h Tudor-SN-SN(1~4)质粒构建及表达成功。 相似文献
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背景 急性脑损伤及其预后的影响因素是多方面的,如年龄、损伤程度与患者体质情况等,但其对外伤性脑损伤的预后结局仅作部分预测.近年来,有关遗传因素对脑损伤的影响和其预后的报道开始增多,关于载脂蛋白E在颅脑外伤预后中所起作用已引起人们的关注.在国外以往的研究中,关于载脂蛋白E基因多态性和脑损伤预后的研究结果也不相同.本研究初步探讨有关我国急性脑损伤及其预后与APOE基因之间的关系.方法 采用病例对照研究,选取94名车祸脑损伤患者和正常人作为研究对象,采用聚合酶链式反应(PCR)限制性片段长度多态性(RFLP)方法鉴定载脂蛋白E(APOE)基因型,探讨其等位基因及基因型同车祸脑损伤及其预后的关系.结果 车祸脑损伤患者中其等位基因ε2频率为0.1010,其基因型ε2/ε3的频率为0.1596明显高于正常人群ε2等位基因频率0.0050,及ε2/ε3基因型的频率0.0100(P<0.05).同时,患者中,其未愈死亡组中ε2等位基因频率为0.1970及ε2/ε3基因型的频率为0.2727,明显高于好转治愈组ε2等位基因频率0.0508及ε2/ε3基因型的频率0.1017(P<0.05),有统计学意义.结论 APOE基因的等位基因ε2基因型ε2/ε3初步可作为预示不良的预后参数. 相似文献
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利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除HeLa细胞中SND1基因,构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株。方法:设计一对特异性识别SND1基因第二个启动子的上下游sgRNA,以PX462质粒为载体,构建出一对重组真核表达质粒。酶切和测序鉴定后,将一对重组质粒共同转染进入HeLa细胞中,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,挑取单克隆细胞进行培养。最后用Western Blot鉴定敲除效果。结果:sgRNA正确插入到PX462质粒载体中,转染并筛选单克隆后的细胞中没有SND1蛋白的表达。结论:成功构建出HeLa细胞SND1基因敲除稳定株。 相似文献
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?目的: 构建Tudor-SN蛋白的Serine426 (S426)、Serine781 (S781)、Threonine240 (T240) 和Threonine429 (T429)的点突变质粒,并使该重组质粒能够在HeLa细胞中融合表达。 方法:利用定点突变技术,对Tudor-SN蛋白进行S426A、S781A、T240A、T429A点突变,通过双酶切的方法获得Tudor- SN.Mutants 片段,最后将其连入到pCMV-N-Flag载体中。在HeLa细胞中转染该质粒,利用Western blot技术检测质粒表达效率。 结果:(1)重组质粒经双酶切鉴定,可以观察到载体与Tudor-SN.Mutants的条带。 (2)转染突变质粒后可看出HeLa细胞中有Flag蛋白表达。结论:质粒构建成功,可以用于下一步科学研究使用。 相似文献