27nt-miRNA通过靶向哺乳动物雷帕霉素靶蛋白调控血管平滑肌细胞凋亡及其分子机制研究

目的:探讨来源于一氧化氮合酶基因第四内含子的27碱基重复序列微小RNA(27nt-miRNA)对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)介导的主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡调控作用及潜在分子机制。方法:将大鼠主动脉VSMC分为空白对照组、雷帕霉素组、27nt-miRNA组、27nt-miRNA反义序列(anti-27ntmiRNA)组、阴性对照组。27nt-miRNA组:转染27nt-miRNA正义链慢病毒载体;anti-27nt-miRNA组:转染27ntmiRNA反义链慢病毒载体;阴性对照组:转染随机阴性序列慢病毒载体。除空白对照组外,雷帕霉素组与各转染组细胞给予100 ng/ml雷帕霉素诱导培养2 h诱导凋亡。荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)验证27nt-miRNA慢病毒稳转细胞株构建情况;CCK-8法、流式细胞术、qRT-PCR法与蛋白免疫印迹(Western blot)法分别检测各组细胞增殖能力、细胞凋亡率与周期分布以及mTOR、磷酸化-mTOR(p-mTOR)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的信使RNA(mRNA)和(或)蛋白表达水平。结果:慢病毒转染VSMC后,27nt-miRNA稳转细胞株构建成功,雷帕霉素可抑制VSMC的mTOR mRNA与p-mTOR蛋白表达水平。与阴性对照组相比,27nt-miRNA组细胞的活力与增殖能力显著增强,且细胞凋亡率显著降低(P均<0.05),细胞周期G1期向S期分裂进程阻滞减弱(P<0.05);Bax和caspase-3蛋白表达量显著减少,Bcl-2蛋白表达量显著增加(P均<0.05);mTOR基因转录水平与p-mTOR蛋白表达水平均下降(P<0.05)。结论:27nt-miRNA通过负调控m TOR基因转录水平与蛋白磷酸化水平抑制VSMC凋亡,其机制可能与上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax和caspase-3蛋白表达有关。     

微RNA-24对过氧化氢诱导的人脐静脉血管内皮细胞凋亡的影响及作用机制

目的探讨微RNA-24(miR-24)对H2O2诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)存活、迁移和凋亡的影响及作用机制。方法通过转染miR-24高表达、miR-24抑制物(anti-miR-24)及其阴性对照慢病毒质粒(miR-24 NC)构建稳转细胞,3种细胞用H2O2500μmol·L^-1处理12 h。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率,划痕实验检测细胞迁移率,Hoechst33258染色及流式细胞术检测细胞凋亡,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-24,Bax,Bcl-2和胱天蛋白酶3 mRNA表达水平,Western印迹法和免疫细胞化学法检测Bax、Bcl-2和胱天蛋白酶3蛋白表达水平。结果与miR-24 NC组比,miR-24高表达组miR-24表达升高(P<0.05),而anti-miR-24组降低(P<0.05)。与正常对照组比,H2O2组细胞凋亡率增加(P<0.05)、细胞存活和迁移率降低(P<0.05),表明氧化损伤模型构建成功。与H2O2+miR-24 NC组比,H2O2+miR-24高表达组上述指标较H2O2+miR-24 NC组升高(P<0.05),促凋亡蛋白Bax和胱天蛋白酶3 mRNA与蛋白表达量增加,抑凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白表达量降低(P<0.05),而H2O2+anti-miR-24组可降低细胞凋亡率、增加细胞存活和迁移率,降低Bax和胱天蛋白酶3 mRNA与蛋白表达水平,增加Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)。结论氧化应激状态下,miR-24可通过上调Bax、胱天蛋白3表达和下调Bcl-2蛋白表达,促进HUVEC凋亡和抑制其存活和迁移能力。     

27nt-miRNA对血管平滑肌细胞SM22α表达的调节及其对细胞活力、迁移和表型改变的影响

目的:探讨27nt-微小RNA(27nt-miRNA)对血管平滑肌细胞(VSMCs)中平滑肌22α蛋白(SM22α表达的调节及其对细胞活力、迁移和表型改变的影响。方法:构建27nt-miRNA高表达、反义序列(anti-27nt-miRNA)以及阴性对照的表达质粒,经慢病毒包装后分别转染大鼠原代VSMCs,加入血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)诱导VSMCs表型转换。MTT实验检测细胞活力,划痕实验检测细胞迁移能力,RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学染色法检测细胞中SM22α的mRNA和蛋白表达情况。结果:与正常组相比,PDGF-BB组的细胞活力上升(P 0.05)、迁移能力上升(P 0.05),SM22α的mRNA及蛋白表达量下降(P 0.05);与阴性对照慢病毒组相比,27nt-miRNA高表达组的细胞活力下降(P 0.05),迁移能力下降(P 0.05),SM22α的mRNA及蛋白表达量明显升高(P 0.05);而anti-27nt-miRNA组细胞的细胞活力上升(P 0.05),迁移能力上升(P 0.05),SM22α的mRNA及蛋白表达量下降(P 0.05)。结论:27nt-miRNA促进SM22α表达,同时抑制VSMCs的活力及迁移,并有可能抑制VSMCs从收缩型转变为合成型。     

miR-24对氧化低密度脂蛋白胆固醇诱导的人脐静脉内皮细胞自噬的影响

目的探讨微小RNA(miR)-24对氧化低密度脂蛋白胆固醇(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬的调控作用及相关分子机制。方法将HUVECs随机分为正常组,ox-LDL组,阴性对照组,anti-miR-24组,miR-24组。正常组细胞正常培养,ox-LDL组细胞用100μg/ml ox-LDL作用6 h诱导自噬,阴性对照组、anti-miR-24组、miR-24组先分别转染相应慢病毒载体,再以同法诱导自噬。实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)验证miR-24慢病毒稳转细胞株构建情况及ox-LDL对HUVECs内miR-24表达的影响;透射电镜观察各组细胞内部自噬小体和自噬溶酶体的数量;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞活性;Western印迹与qRT-PCR法检测LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、P62的蛋白和mRNA表达水平。结果慢病毒转染细胞成功后miR-24的表达受到影响;ox-LDL可诱导下调miR-24在HUVECs中的表达(P<0.05);与阴性对照组相比,anti-miR-24组细胞质内自噬小体及自噬溶酶体显著增加(P<0.05),但细胞活性无显著差异(P>0.05),LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1的蛋白及mRNA相对表达量显著增高(P<0.05),P62的蛋白及mRNA相对表达量降低(P<0.05)。然而,miR-24组细胞质内自噬小体及自噬溶酶体显著减少,且细胞活性显著性降低(P<0.05),LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1的蛋白及mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),P62的蛋白及mRNA相对表达量升高(P<0.05)。结论过表达miR-24可通过抑制ox-LDL诱导的HUVECs自噬进而抑制细胞增殖,miR-24可能成为动脉粥样硬化(AS)的潜在治疗靶点。     

27nt-miRNA对氧化低密度脂蛋白介导的血管内皮细胞管腔形成活性减弱的影响及其分子机制

目的 探讨27nt-miRNA对氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)介导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移和管腔形成能力减弱的影响及相关分子机制.方法 将HUVECs分为正常对照组、Ox-LDL组、27nt-miRNA组、27nt-miRNA反义序列(anti-27nt-miRNA)组和miR-NC组.正常对照组...     

27nt-miRNA对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的:探讨27nt-miRNA(27nt-miR)对氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的影响及分子机制。方法:体外培养HUVECs,分为正常对照组、Ox-LDL组、27nt-miR+Ox-LDL组、anti-27nt-miR+Ox-LDL组和阴性对照+Ox-LDL组。正常对照组给予正常培养;Ox-LDL组用40 mg/L Ox-LDL作用48 h诱导细胞凋亡;27nt-miR+Ox-LDL组、anti-27nt-miR+Ox-LDL组及阴性对照+Ox-LDL组分别以相同的操作方法转染相应慢病毒质粒后用40 mg/L Ox-LDL作用48 h诱导细胞凋亡。采用CCK-8法检测细胞活力,划痕实验检测细胞的迁移能力,caspase-3活性试剂盒检测细胞内caspase-3活性,RT-qPCR法和Western blot法检测细胞内Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA及蛋白的表达情况。结果:与阴性对照+Ox-LDL组相比,27nt-miR+Ox-LDL组HUVECs的27ntmiR高表达可显著降低细胞活力和迁移能力(P<0.05),显著...