抗人HPPCn单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备高灵敏度的抗人HPPCn单克隆抗体(mAb),以用于HPPCn的功能研究及其疾病相关性研究。方法:用重组蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术进行细胞融合,经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆,获得稳定分泌抗人HPPCn mAb的细胞株。采用间接ELISA、Western blot、Ig亚类快速定性试纸分析法等鉴定抗体的生物学特性;通过细胞免疫荧光实验观察了HPPCn蛋白的细胞定位。通过噬菌体肽库技术分析抗体所识别的抗原表位。结果:得到了1株稳定分泌抗人HPPCn抗体的杂交瘤细胞株,命名为W2-D5。经Ig亚类分析确定,该细胞株分泌的抗体属于IgG1亚类。间接ELISA检测表明,该抗体检测HPPCn的极限为0.1μg/L;Western blot结果显示,该抗体能特异性识别HPPCn。细胞免疫荧光实验,证实了HPPCn蛋白定位在细胞核。通过肽库筛选及表位分析认为,该抗体识别的表位可能为HPPCn7-13(IHLELRN)。结论:成功地获得了抗人HPPCn的特异性mAb。     

重组人降钙素原的制备及发酵优化

目的 制备人降钙素原(PCT)蛋白,用于抗体制备及检测试剂盒的研制。方法 通过分子克隆技术构建人PCT重组表达质粒(pET28a-PCT),以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞,进行PCT的原核表达,利用发酵罐进行大肠杆菌的高密度培养并优化发酵条件,镍柱纯化重组蛋白。标定重组蛋白水平后,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)验证重组蛋白作为标准蛋白在绘制水平-吸光度标准曲线中的应用价值。结果 培养大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-PCT,经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,重组蛋白主要表达在细菌裂解上清液中。利用发酵罐优化溶氧量、补料及温度等参数,培养温度40℃,溶氧量设定为30%,10×肉汤(LB)浓缩培养基以100 mL/h速度加入补料,以IPTG终浓度0.2 mmol/L诱导4 h, PCT产量为1 405 mg/L,镍柱亲和纯化后,纯度超过90%。用ELISA试剂盒标定重组蛋白。绘制水平-吸光度标准曲线,PCT与试剂盒提供的标准蛋白之间几乎没有差异。结论 该研究通过发酵表达及亲和纯化的方式,制备了高纯度的PCT蛋白,为PCT抗体的制备及PCT检测试剂盒的开发提...