核糖体蛋白S6激酶1抑制剂对气道上皮干/祖细胞 增殖及分化功能的影响

李敏敏 1,李宽 1,2,孙昕 1,2,吴琦 1,2,陈怀永 摘要：目的 研究mTOR信号通路下游元件核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）抑制剂PF-4708671对气道干/祖细胞增 殖与分化功能的影响。方法 准备10只C57BL/6小鼠,采用流式细胞分选技术将气道干细胞（vClub）和气道祖细胞 （Club）从小鼠气道分选出来;采用类器官培养技术分别把vClub细胞、Club细胞和成纤维细胞（MLg）混合培养。细胞 设0、4、20、100 nmol/L PF-4708671处理组,培养第8天时显微镜下观察克隆生长情况,统计克隆形成数量;第10天时 荧光定量PCR检测S6K1激酶基因Rps6kb1、Club细胞标志物细胞色素氧化酶（Cyp2f2）、纤毛细胞标志物乙酰化微管 蛋白（Act）和叉头框转录因子J1（Fox j1）,杯状细胞标志物氯化物通道钙活化家族成员3（Clca3）叉头框转录因子a3 （Foxa3）的mRNA表达情况。结果 不同浓度的PF-4708671对vClub细胞克隆数量无明显影响（P＞0.05）,而4、20、 100 nmol/L PF-4708671浓度组Club细胞克隆数量均较0 nmol/L组减少（P＜0.05）。不同浓度的PF-4708671对vClub 向Club细胞的分化无明显影响,其特征分子Cyp2f2在mRNA表达水平差异方面无统计学意义。PF-4708671对Club 细胞向纤毛细胞和杯状细胞的分化能力均无明显影响,4组间2种细胞的标志物Act、Fox j1及Clca3、Foxa3表达水平 差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 mTOR/S6K1信号通路对小鼠气道干/祖细胞的增殖功能呈正调控作用,对其 分化功能影响甚微。     

气道类器官研究哮喘中Lkb1调控上皮再生的机制

目的 通过气道类器官培养研究哮喘中肝激酶B1(Lkb1)调控上皮再生的机制。方法 取Lkb1^f/f(对照组,10只)和Scgb1a1^CreER;Lkb1^f/f小鼠(Lkb1敲除组,9只),采用雾化吸入鸡卵清蛋白(OVA)的方法建立过敏性哮喘模型,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织,统计BALF中炎性细胞数量,肺组织切片免疫荧光染色比较钙激活氯离子通道蛋白3(CLCA3)阳性细胞数量。通过流式细胞术分选出Club细胞进行类器官培养,统计类器官的平均直径和类器官形成率,回收细胞通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测高脚杯细胞标志物CLCA3、纤毛细胞标志物叉头框蛋白J1(FOXJ1)和Club细胞中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的表达水平。结果 与对照组相比,Lkb1敲除组BALF中巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量变化差异无统计学意义;Lkb1敲除后CLCA3阳性细胞数量减少;类器官培养结果显示敲除Lkb1后Club细胞来源的类器官平均直径减小,类器官形成率降低,纤毛细胞分化标志物FOXJ1 m...     

银耳孢糖的化学结构初步研究及其免疫活性

目的：从银耳孢糖中分离、纯化3种均一多糖，TSP-2a～TSP-2c，研究其结构特征及生物活性.方法：银耳孢糖经DEAE-SephadexA-50分离得TSP-2，进一步采用SephadexG-150分离纯化得TSP-2a～2c，经凝胶色谱法和HPGPC方法鉴定其纯度.利用化学方法和色谱及光谱分析方法进行结构研究.采用放射免疫法测定了TSP-2、TSP-2a～TSP-2c刺激人外周血单核细胞（PBMC）后促进细胞因子IL-1α、IL-6、IL-8分泌的增加.结果：TSP-2a～TSP-2c为均一多糖，分子量分别为1100kD、500kD、400kD．组成糖为岩藻糖（Fuc）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）和葡萄糖醛酸（GlcA）.其结构都以（1→3）一D—Man为主链，并在O-2，O-4，O-6位上有分支点.各均一多糖在不同程度上对细胞因子的产生起到促进作用．结论：TSP-2a～TSP-2c均为一多分枝的结构复杂的酸性杂多糖，具有显著的免疫活性.     

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶抑制剂对小鼠气道Club细胞增殖的影响#br#

目的　探讨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）抑制剂6-氨基烟酰胺（6-AN）对小鼠气道Club细胞增殖的影响。方法　C57BL/6 小鼠随机分为对照组和哮喘组，哮喘组小鼠采用腹腔注射与雾化吸入鸡卵清蛋白（OVA）的方法建立哮喘模型。造模成功后取肺组织，进行免疫荧光染色，统计小鼠气道中Ki67+CCSP+细胞占CCSP+细胞的比例。利用流式细胞术分选出Club细胞后，用荧光定量PCR法测定glucose-6-phosphate dehydrogenase X-linked（G6pdx）mRNA的表达情况。利用类器官培养法培养Club细胞，设0、10 μmol/L 6-AN组，统计第8天克隆的平均直径和克隆形成数量。结果　与对照组相比，哮喘组气道Ki67+CCSP+细胞占CCSP+细胞百分比显著升高（P＜0.01）。哮喘组Club细胞G6pdx mRNA表达较对照组显著上调（P＜0.01）。10 μmol/L 6-AN组Club细胞的克隆平均直径和克隆形成数量较0 μmol/L 6-AN组均显著降低（P＜0.01）。结论　G6PD抑制剂6-AN可抑制小鼠气道Club细胞增殖功能。     

气道上皮细胞紧密连接在小鼠哮喘中的病理学改变

摘要： 目的 探讨小鼠支气管哮喘 （哮喘） 中气道上皮紧密连接的病理学改变。方法 10 只小鼠随机分为对照组和哮喘组, 每组 5 只。哮喘组于第 0、 7 天腹腔注射鸡卵清蛋白 （OVA） 溶液, 在第 14、 15、 16 天以雾化的 OVA 熏诱小鼠, 1 h/次、 1 次/d; 对照组用 PBS 溶液替代 OVA; 2 组小鼠在第 18 天回收肺组织, 采用免疫荧光染色法评价小鼠哮喘模型的有效性, 荧光定量 PCR检测紧密连接相关蛋白基因Claudin 1、 Claudin 3、 Claudin 4、 Claudin 5、 Claudin 7、 Clau⁃ din 10在肺组织中的表达。结果 哮喘组 Claudin 3、 Claudin 4、 Claudin 10 mRNA 水平较对照组低 （P＜0.05）, 而 Clau⁃ din 1、 Claudin 5、 Claudin 7 mRNA 水平与对照组比较差异无统计学意义 （P＞0.05）。结论 哮喘病理过程中气道上皮细胞紧密连接松散, 提示气道上皮屏障破坏。     

NO介导的代谢紊乱影响小鼠气道祖细胞增殖的机制研究

目的 研究一氧化氮(NO)对小鼠气道club祖细胞增殖功能的调控及可能代谢机制。方法 使用流式分选技术分选小鼠气道原代club祖细胞，经25μmol/L的NO供体二乙胺壬酸酯(DEA NONOate)处理后进行转录组测序；分选小鼠气道原代club祖细胞，使用肺脏类器官技术体外培养原代club祖细胞，分别加入正常培养基，40 nmol/L辛伐他汀(Hmgcr抑制剂)，0.2μmol/L 6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(DON,Gmps抑制剂)，1 mmol/L氨基羟乙酸酯(AOA,Gpt2抑制剂)培养基，在培养第8天时使用倒置显微镜拍照，观察原代club祖细胞衍生类器官生长情况，并统计类器官直径和形成效率。结果 DEA NONOate处理原代club祖细胞转录组表达显著变化(上调倍数超过1.2倍的基因2 894个，下调16.7%以上的基因3 270个)，其中代谢相关基因Hmgcr、Gmps和Gpt2的表达量显著下降(P<0.01)。与对照组相比，辛伐他汀组原代club祖细胞形成的类器官直径减小(P<0.01)，类器官形成效率没有变化；DON组类器官直径减小(P<0.0...