miR-186海绵载体的构建及其在EA.hy926细胞株中的表达

目的：构建微小RNA-186（miR-186）基因的海绵载体,建立稳定敲减miR-186的EA.hy926细胞株。方法：化学合成miR-186海绵体序列,并克隆到慢病毒FV040表达载体上;采用lipofectamine 2000共转染FV040-miR-186-sponge载体和慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞,包装慢病毒,测定病毒滴度;FV040-control慢病毒作为对照组,FV040-miR-186-sponge作为实验组,分别感染EA.hy926细胞,筛选稳转细胞株;采用荧光定量PCR （qPCR）法检测空白对照组、FV040-control对照组及FV040-miR-186-sponge实验组中EA.hy926细胞miR-186的相对表达水平。结果：测序结果显示克隆的目的基因序列与设计的miR-186海绵体序列完全一致。在感染的EA.hy926细胞中观察到绿色荧光蛋白（GFP）的表达。FV040-control包装的慢病毒滴度为2×10⁸ TU·mL^-1,FV040-miR-186-sponge组慢病毒滴度为6×10⁸ TU·mL^-1;成功建立了稳定表达miR-186-sponge的EA.hy926细胞株,感染效率达95%;qPCR检测,与空白对照组和FV040-control组比较,FV040-miR-186-sponge组EA.hy926细胞中miR-186相对表达水平降低（P<0.01）。结论：成功构建了miR-186基因的海绵载体,建立了稳定下调miR-186表达的EA.hy926-miR-186-sponge细胞株。     

脑损伤性癫痫的临床观察和护理干预分析

目的研究分析脑损伤性癫痫的临床护理干预措施,以提高护理质量。方法选择2010年3月至2012年3月我科收治的脑损伤性癫痫患者58例为实验对象,随机分为两组。对照组患者29例,给予常规护理措施;实验组患者29例,给予综合护理干预,对比观察两组护理效果。结果实验组患者护理干预后的焦虑程度降低、患者对疾病的不确定感降低,癫痫对生活的影响程度降低,与对照组患者比较差异有显著性（P〈0．05）。实验组患者对护理工作满意度上升（P〈0．05）。结论在脑损伤性癫痫的临床护理工作中给予综合护理干预,有助于降低患者负性情绪,提高生活质量,值得应用。     

针对性疼痛护理干预对重症监护室疼痛新生儿的应用效果

目的：探讨针对性疼痛护理干预对重症监护室新生儿的应用效果。方法：选取2020年1-10月广东省揭阳市普宁市人民医院新生儿重症监护室收治的90例疼痛患儿作为研究对象,将其分为对照组和观察组,各45例。观察组实施针对性疼痛护理干预,对照组实施常规护理,对比两组症状改善时间、疼痛控制时间、重症监护时间、应激反应发生率、新生儿疼痛(NIPS)评分、体质量及家属满意度。结果：观察组症状改善时间、疼痛控制时间、重症监护时间均短于对照组,应激反应发生率低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);观察组患儿出科时NIPS评分低于对照组,体质量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组患儿家属对护理的满意度高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：为新生儿疼痛患儿开展重症监护时,给予其针对性疼痛护理干预,可强化护理效果,缓解疼痛,缩短重症监护时间,提高患儿家属的护理满意度,建议推广。     

miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞（HEK）293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法：以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体。利用Lipofectamine 2000将重组慢病毒质粒FV040 Vector和FV040 miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48 h后收集慢病毒,以FV040 Vector慢病毒作为对照组,FV040 miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞。感染48 h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平。结果：测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致。与对照组（0.8387±0.1456）比较,实验组HEK 293T细胞中miR-186表达水平（12.6400±0.7884）明显升高（t=14.72,P<0.01）,约为对照组的15.07倍。结论：成功构建miR-186过表达慢病毒载体并包装出慢病毒,miR-186慢病毒成功感染HEK293T细胞,miR-186表达水平在HEK293T细胞中明显升高。     

降温毯治疗重度脑损伤的护理

目的探讨研究降温毯治疗重度脑损伤期间的有效护理模式。方法将我科2009年9月至2012年7月收治的重度脑损伤患者60例随机分为两组,对照组30例给予常规护理,实验组30例给予细节护理干预,对比观察两组患者护理干预后的效果。结果两组患者治疗效果比较差异无显著性（P〉0．05）;实验组患者通过细节护理干预,降温毯使用期间不良事件发生率低,存活患者住院时间短,与对照组比较差异有显著性（P〈0．05）。结论降温毯治疗重度脑损伤期间给予细节护理干预效果较好,可以减少治疗期间的并发症,缩短患者住院时间,减轻其经济负担。     

高龄重型颅脑损伤患者的急救与护理体会

目的分析探讨高龄重型颅脑损伤患者急救和护理对策。方法对我科2010年1月至2012年6月急救的80例高龄重型颅脑损伤患者临床资料进行回顾性分析。结果65例高龄重型颅脑损伤患者被抢救成功,抢救成功率是81．25％,另外15例高龄重型颅脑损伤患者抢救无效死亡,病死率是18．75％。结论对高龄重型颅脑损伤患者实施及时有效的急救和护理措施,能够提高抢救成功率,减少患者伤残和死亡,降低并发症发生率。     

RHBDF2-shRNA慢病毒载体的构建和Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系的建立

目的：构建RHBDF2-shRNA慢病毒载体,建立Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,并检测稳转细胞株中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。方法：根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成针对RHBDF2基因干扰靶点的shRNA-oligo,退火后将其连接到经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒载体FV067-RNAi-EGFP-Puro中,构建FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒,通过PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。使用HEK293T细胞和Neuro-2a细胞作为实验材料,FV067 Vector作为对照组,FV067-RHBDF2-shRNA作为实验组。通过Lipofectamine 2000将FV067 Vector和FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒分别与慢病毒辅助质粒psPAX2和pMD2G共转染至HEK293T细胞中,转染48 h收集并纯化慢病毒,分别将对照组FV067 Vector和实验组FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒在感染复数（MOI）为50时感染Neuro-2a细胞,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,采用2 mg·L^-1嘌呤霉素筛选出RHBDF2基因稳定沉默的细胞系。实时荧光定量PCR法检测2组细胞中RHBDF2 mRNA表达水平,免疫印迹法检测2组细胞中RHBDF2蛋白表达水平。结果：PCR和测序,RHBDF2-shRNA慢病毒载体中的干扰序列与设计合成的RHBDF2-shRNA-oligo序列完全一致。FV067 Vector慢病毒的滴度为5×10⁸ TU·mL^-1,FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒的滴度为3×10⁸ TU·mL^-1。实时荧光定量PCR检测,实验组稳转细胞株中RHBDF2 mRNA表达水平比对照组降低了52.26%（t=11.44,P=0.0076）。免疫印迹法检测,与对照组比较,实验组RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2蛋白表达水平降低了47%（t=6.374,P=0.0078）。结论：成功构建了FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒载体并建立了Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,且Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2mRNA和蛋白表达水平明显降低。     

RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞系的建立

目的：构建RHBDF2基因过表达慢病毒载体,建立稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞,为RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞的建立提供依据。方法：根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成引物,PCR扩增RHBDF2基因后通过Gateway克隆技术将目的基因克隆至入门载体,再亚克隆至慢病毒载体pLV[Exp]-EGFP,构建重组慢病毒质粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2;将慢病毒表达载体质粒pLV[Exp]-EGFP和重组慢病毒质粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2分别与慢病毒辅助包装质粒共转染HEK293T细胞,包装慢病毒并测定慢病毒滴度;将感染pLV[Exp]-EGFP-control的EA.hy926细胞作为对照组,感染pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2的EA.hy926细胞作为实验组,利用嘌呤霉素筛选出稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞;荧光定量PCR （qPCR）和Western blotting法检测对照组和实验组EA.hy926细胞中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。结果：酶切电泳和测序检测,实验组过表达慢病毒载体的基因序列与设计合成的序列完全一致;对照组包装的慢病毒滴度为1×10⁸ TU·mL^-1,实验组慢病毒的滴度为3×10⁸ TU·mL^-1;荧光显微镜下慢病毒成功感染EA.hy926细胞,感染率达95%以上;qPCR检测,实验组EA.hy926细胞中RHBDF2 mRNA表达水平较对照组明显升高（P<0.01）;Western blotting法检测,实验组EA.hy926细胞中RHBDF2蛋白表达水平较对照组明显升高（P<0.05）。结论：成功构建RHBDF2过表达慢病毒载体,利用pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒建立了稳定上调RHBDF2表达的EA.hy926细胞系。