大肠杆菌碱性磷酸酶在E.coli BL21(DE3)中的胞内可溶性表达

目的 构建原核表达载体pEAP,在E.coil BL21(DE3)中实现大肠杆菌碱性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase,EAP)的胞内可溶性表达,为进一步研究工程菌的大体积培养条件、提高其表达量提供理论基础.方法 以质粒pDAP2为模板扩增不含信号肽的EAP基因,克隆至pGreen-S质粒构建表达载体pEAP,以E.coli BL21(ED3)菌株表达EAP,采用SDS-PAGE及EAP酶活性测定对表达产物的可溶性及胞内定位进行分析;Ni2+亲和层析方式纯化目的蛋白并测定其比活力.结果 经PCR、双酶切及测序分析证实载体构建正确,所表达目的蛋白主要以可溶性形式存在于BL21(ED3)菌体细胞质,其相对分子量与理论值相符(47kD)且具有EAP催化活性;目的蛋白经His Trap亲和层析纯化后,其电泳纯度在90％以上,酶比活力可达358.6 U/mg.结论 成功构建pEAP质粒表达载体,目的蛋白在BL21(ED3)菌株胞内主要以可溶性形式表达,为进一步更经济、高效制备EAP奠定了一定的实验基础.