过表达 C3aR人足细胞的构建及鉴定

目的：构建过表达C3a受体（C3aR）的肾小球足细胞株,为探讨C3aR在肾小球足细胞中的确切生理和病理意义提供细胞模型。方法设计合成人C3aR 表达单元,将其克隆到慢病毒表达载体pLenti6．3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位点,构建成C3aR表达载体pLenti6．3-C3aR-IRES2-EGFP;将pLenti6．3-C3aR-IRES2-EGFP和包装质粒共转染293 T细胞,包装成C3aR表达重组慢病毒LV-C3aR;以LV-C3aR感染人肾小球足细胞系HPC,根据LV-C3aR上带有杀稻瘟菌素抗性基因的特点,以杀稻瘟菌素筛选稳定转染细胞克隆;利用荧光定量PCR和细胞免疫化学分析方法对稳定转染细胞克隆的C3aR表达水平进行分析,从中鉴定出稳定过表达C3aR的人肾小球足细胞株。结果成功构建了C3aR表达载体pLenti6．3-C3aR-IRES2-EGFP;得到了高滴度的C3aR表达重组慢病毒LV-C3aR;成功构建了过表达C3aR的人肾小球足细胞株HPC-C3aR。结论成功构建C3 aR表达载体和过表达C3 aR的人肾小球足细胞株,为进一步研究C3 aR过表达在人肾小球足细胞中的病理意义提供了很好的细胞模型,也为进一步开展C3 aR在其他细胞中的生理、病理意义创造了条件。     

糖尿病肾病小鼠新相关基因表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：构建小鼠“REKEN cDNA 0610006H10”基因表达载体pPRO-6AB，了解此表达载体在大肠杆菌中表达的情况。方法：从克隆有“REKEN cDNA 0610006H10”基因cDNA的载体pUCm-6AB中切取长约1．1kb的“REKENcDNA 0610006H10”基因cDNA，将它克隆到原核表达载体pPROTet-E的多克隆位点中。以限制性内切酶酶切分析的方法对重组克隆进行初步鉴定，以测序法对重组子进行验证。在确证得到了预期的表达载体pPRO-6AB后，以氯化钙转染法将表达载体导人大肠杆菌BL21PRO中作蛋白表达分析。蛋白分析方法采用SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，所用胶浓度为10％，交联度为3．3％。电泳结束后利用考马丝亮蓝染色法进行染色。结果：得到了预期的“REKEN cDNA 0610006H10”基因原核表达载体pPRO-6AB“REKEN cDNA 0610006H10”基因成功地在大肠杆菌中实现了表达。结论：我们成功地构建了小鼠“REKEN cDNA 0610006H10”基因表达载体pPRO-6AB，在大肠杆菌中成功地进行了“REKEN cDNA 0610006H10”基因的表达，从而为进一步研究“REKEN cDNA 0610006H10”基因编码蛋白的结构和功能，探讨“REKEN cDNA 0610006H10”基因在糖尿病肾病发生、发展过程中的可能作用创造了条件。     

肥大细胞在糖尿病肾病患者肾组织中的分布及相关性研究

目的 糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是慢性炎症性疾病.肥大细胞是多功能的免疫细胞,具有以多种方式参与DN发生发展的潜在能力.但目前尚未见有较全面的对肥大细胞与DN关系的分析和研究报道.文中研究在DN发生发展过程中肾组织中肥大细胞数量、活化水平的变化,及探讨肥大细胞与DN发生发展的相关性及可能病理作用.方法 选取DN病例80例,其中早期19例、中期32例,晚期29例.同时选取正常供肾16例作为正常对照.以类胰蛋白酶作为肥大细胞标记分子,利用免疫组化的方法分析肾穿刺组织标本中肥大细胞的数量.以CD3、CD20、CD68分别作为肾组织T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞的标记分子,利用免疫组化染色方法分析肾穿刺组织标本中上述炎症细胞数量.根据肥大细胞周围的甲苯胺蓝异染颗粒及细胞内颗粒减少情况分析肥大细胞的脱颗粒反应,据以分析肾织织肥大细胞的活化水平.以此为基础分析肾组织中肥大细胞与DN临床病理指标的相关性.结果 ①在正常对照和DN患者的肾组织中肥大细胞主要分布于肾小管间质,肾小球中极少发现肥大细胞.DN患者的肾组织中,还可见肥大细胞侵入肾小管壁.②正常对照肾组织肥大细胞数量很少.在DN的肾组织中,肥大细胞数量随着病情发展而显著增加.③与正常对照相比,DN患者肾组织肥大细胞发生脱颗粒的比例显著增高,且表现为随DN进展而逐渐增加的趋势.④相关性分析显示,DN患者肾组织肥大细胞数量与肾功能损伤指标、小管间质损伤指标和炎症指标具有显著相关性.结论 肥大细胞参与DN的发生发展过程,可能主要通过脱颗粒作用,释放细胞内的生物活性物质.肥大细胞在DN的肾小管间质损伤中发挥重要作用.肥大细胞可望成为DN防治的新靶标.     

条件性基因打靶及其研究进展

条件性基因打靶是在常规的基因打靶 (基于同源重组原理的基因打靶 )的基础上 ,结合重组酶介导的位点特异性重组技术而发展起来的一种基因打靶新方法。与常规的基因打靶方法相比 ,它对生物基因组的修饰具有时空可控性 ,显示出广阔的应用前景。本文主要就条件性基因打靶的原理、方法、特点及应用前景作一综述     

基因组修饰研究的策略

人类基因组计划的完成使人类对自身奥秘的探索进入了一个全新的阶段。但人类基因组计划本身并没有说明太多的问题 ,大量的人类基因组“诠释”工作 (基因功能研究 )才是意义之所在。研究基因功能的方法有多种 ,而最为直接 ,也是最为可靠的则是对基因组的直接修饰 :即转基因和基因敲除。由于具有饲养方便、繁殖迅速、与人类基因组的相似性高等特点 ,小鼠已成为研究哺乳动物基因功能的理想模型动物。与此相对应 ,近年来已发展了一系列关于构建转基因小鼠和基因敲除小鼠的策略和方法。利用这些方法产生了数以千计的转基因小鼠和基因敲除小鼠 ,为…     

线粒体与细胞功能调节

长期以来,人们对线粒体功能的关注,主要集中于线粒体在细胞代谢方面的作用。作为细胞的一个主要代谢场所,线粒体在细胞中的重要性是显而易见的:糖酵解产生的丙酮酸在这里彻底分解成二氧化碳和水;长链脂肪酸在这里进行β氧化,产生的乙酰辅酶A也在这里最后彻底分解;此外,脂肪酸、     

条件性基因打靶及其研究进展

条件性基因打靶是在常规的基因打靶（基于同源重组原理的基因打靶）的基础上,结合重组酶介导的位点特异性重组技术而发展起来的一种基因打靶新方法。与常规的基因打靶方法相比,它对生物基因组的修饰具有时空可控性,显示出广阔的应用前景。本主要就条件性基因打靶的原理、方法、特点及应用前景作一综述。     

血管生成素样蛋白2在糖尿病肾病中的表达及意义

目的：观察一种新发现的血管生成相关生长因子-血管生成素样蛋白2（ANGPTL2）在糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）肾小球中的表达特征，并对其在DN发生发展过程中可能的作用机制进行初步探讨：方法：采用肾活检组织肾小球微分离技术结合半定量RT—PCR方法，观察24例2型DN患者肾小球中ANGPTL2 mRNA表达情况，以8例移植供肾活检组织作正常对照：并将其表达水平与DN患者临床病理指标进行相关分析。结果：DN患者肾小球ANGPTL2表达阳性率显著高于对照组（95％vs38％，χ^2=15．9，P〈0．01）。在表达明显上调（〉2倍）的患者中，肾小球做血管瘤、内皮细胞炎性浸润与泡沫化变性的发生率明显少于其他患者（22％vs66％；11％vs3％；11％vs53％；P〈0．05）。结论：ANGPTL2是一种血管生成相关的内皮细胞生长调节因子，参与DN微血管病变的发生机制.该因子在糖尿病肾小球中表达的上调可能是内皮损伤与血管重构过程中的一种应激性反应，具有维持内皮细胞功能与毛细血管正常结构的保护性作用.     

糖尿病肾病患者尿液糜蛋白酶检测及其病理意义分析

目的：了解肥大细胞糜蛋白酶在糖尿病肾病患者尿液中的表达及其与糖尿病肾病临床指标的相关性,探讨糜蛋白酶和肥大细胞在糖尿病肾病肾组织损伤中的作用。方法收集糖尿病肾病103例（包括糖尿病肾病早期10例、中期31例和晚期62例）和20例正常对照者的尿液;利用ELISA法检测尿中糜蛋白酶水平;比较分析尿液糜蛋白酶在正常对照组、糖尿病肾病早期组、中期组和晚期组中的变化情况及其与患者各临床指标的相关性。结果与正常对照组相比,糖尿病肾病患者尿液中糜蛋白酶的水平显著升高,表现为随糖尿病肾病的发展而逐渐增加的趋势。糖尿病肾病患者尿液糜蛋白酶水平与血肌酐[相关系数（r）＝0．446,P＜0．01]、血胱蛋白酶抑制剂C（r＝0．398,P＜0．01）、血尿素氮（r＝0．365,P＜0．01）、24 h尿蛋白（r＝0．512,P＜0．01）、尿C3（r＝0．321,P＜0．01）、尿视黄醇结合蛋白（r＝0．432,P＜0．01）、尿溶菌酶（r＝0．482,P＜0.01）、尿N-乙酰-β-葡萄糖苷酶（r＝0．582,P＜0．01）水平具有显著相关性。结论上述结果支持关于肥大细胞参与糖尿病肾病肾组织损伤的观点,提示肾组织肥大细胞及其分泌的糜蛋白酶很可能在糖尿病肾病肾组织损伤中具有重要作用并可能是糖尿病肾病防治的新靶标。