逆转录—聚合酶链反应—酶联夹心杂交法定量检测IL—6mRNA

目的：建立一支高灵敏度、高特异性、精确、简便的逆转录－聚合酶链反应－微孔板酶联夹心杂交技术定量检测人IL－6mRNA的方法。方法：从人外周静脉血单个核细胞提取总RNA，进行RT－PCR扩增，PCR产物经热变性后与检测探针一起加入已包被捕获探针的微孔板内进行夹心杂交，用链亲和素－辣根过氧化物酶（SAV－HRP）及底物系统检测杂交信号。结果：该方法检测IL－6mRNA的灵敏度明显高于逆转录－聚合酶链反应－琼脂糖凝胶电泳；特异性高，RT－PCR和酶联夹心杂交均无非特异性阳性信号出现；重复性良好。结论：本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化，适合于细胞因子mRNA的定量检测。     

人IL-6 mRNA的实时定量检测法

目的：建立TaqMan-MGB技术实时定量检测人IL-6 mRNA的方法，并用于检测人外周血单个核细胞在牛膝多糖诱导下IL-6 mRNA的表达。方法：（1）抽取人外周静脉血，EDTA抗凝，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，用Trizol裂解液提取总RNA，将总RNA逆转录为cDNA，PCR扩增IL-6后纯化PCR产物，与pMD 18-T载体进行连接，转化宿主菌DH-5α。提取重组质粒DNA，作为实时荧光定量检测的标准品。建立TaqMan-MGB技术实时定量检测IL-6 mRNA的方法。（2）终浓度分别为0、100、200、400、800和1 600 mg/L的牛膝多糖作用于人外周血单个核细胞，定量检测IL-6 mRNA的表达。结果：（1）酶切分析、PCR扩增以及测序结果均证实IL-6 cDNA成功重组到pMD 18-T载体上。（2）TaqMan-MGB技术检测IL-6 mRNA线性范围广；灵敏度高；特异性好；重复性好。（3）牛膝多糖作用于人外周血单个核细胞后IL-6 mRNA表达增高。结论：TaqMan-MGB技术能较为精确地定量IL-6 mRNA。     

杆状病毒表面展示丙型肝炎病毒结构蛋白及其对丙型肝炎病毒的检测

目的: 利用杆状病毒表面展示系统对丙型肝炎病毒(HCV)进行早期检测。方法: 利用杆状病毒表面展示(baculovirus surface display) 技术,构建展示HCV结构蛋白的重组杆状病毒vAc-Flag-HCV C-GP64、vAc-Flag-HCV E-GP64和vAc-Flag-CE-GP64。结果: (1)Western blotting 分析结果表明重组杆状病毒表达了C(HCV核心蛋白)、E(HCV包膜蛋白)和CE蛋白。(2)激光共聚焦显微镜检测结果表明,重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf9后在昆虫细胞膜上表达了C、E和CE蛋白。(3)免疫金电子显微镜观察表明重组蛋白展示在杆状病毒囊膜上。(4)重组病毒进行浓缩纯化后,利用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术对HCV样本进行检测,vAc-Flag-CE-GP64的检测阳性率可达80.2%。结论: vAc-Flag-CE-GP64可用于对HCV进行早期检测。     

自然流产患者蜕膜组织TNF-α及TGF-β1mRNA的表达分析

目的研究自然流产患者子宫蜕膜组织中细胞因子TNF-α和TGF-β1mRNA的表达格局。方法采用实时荧光定量RT-PCR法检测了15例早期自然流产及20例同期正常早孕要求行人工流产者蜕膜组织的TNF-α和TGF-β1mRNA表达水平。结果流产组和对照组蜕膜组织TNF-αmRNA的表达水平分别为1.98±0.52和1.08±0.10;TGF-β1mRNA的表达水平分别为0.82±0.34和1.41±0.23。统计结果显示,与对照组相比,早期自然流产病人的蜕膜组织中TNF-αmRNA的表达水平明显增加(P<0.01),而TGF-β1mRNA的表达水平则显著降低(P<0.01)。结论早期自然流产的发生可能与母胎界面TNF-α和TGF-β1mRNA的异常表达有关。     

实时定量PCR检测细菌中blaCYX-M-14基因

目的 探索实时定量PCR检测临床、环境细菌中blaCYX-M-14基因流行情况.方法 将收集的65份标本先用ESBL表型确认试验及其KB琼脂扩散法初筛,然后通过菌落平板计数,实时定量PCR方法测出细菌blaCYX-M-14基因C(t)值,最终计算得到平均每个待测细菌中的blaCYX-M-14基因的单个拷贝数.结果 从65份标本中分离得到4株产ESBLs的大肠埃希菌,实时定量PCR检测后得到四株细菌的blaCYX-M-14基因C(t)值依次为11.08,11.63,11.80,13.46,拷贝数分别为6.92×107copies/μl菌液,4.67×107copies/μl菌液,4.22×107copies/μl菌液,1.35×107copies/菌液,即1.05copies/细菌,1.90copies/细菌,2.92copies/细菌,1.10copies/细菌.结论 细菌blaCYX-M-14基因拷贝数的高低与细菌多重耐药现象正相关,建立的实时定量PCR检测细菌中blaCYX-M-14基因的方法具有直观,快捷的优点,有助于检测临床及其环境中耐药菌blaCYX-M-14基因流行情况.     

脂多糖对人单个核细胞白细胞介素-6基因表达的影响

目的：探讨脂多糖(LPS)对人单个核细胞表达白细胞介素-6(IL-6)mRNA的影响。方法：抽取人外周静脉血，经EDTA抗凝，LPS刺激培养，分离单个核细胞并提取总RNA，将总RNA逆转录为cDNA，然后用IL-6引物进行热启动PCR扩增。扩增产物热变性后与IL-6检测探针、捕获探针进行夹心杂交，最后加入亲和素-辣根过氧化物酶及其底物，显色检测杂交信号。IL-6引物及探针用Primer Premier 5．0软件设计。结果：LPS可在转录水平上诱导IL-6 mRNA表达，其作用强度与LPS剂量呈正相关；IL-6 mRNA表达丰度有时间效应，刺激4h后，IL-6 mRNA的表达最高。结论：LPS能显著增强人单个核细胞表达IL-6 mRNA。     

逆转录-聚合酶链反应-酶联夹心杂交法半定量检测人白细胞介素-6 mRNA

白细胞介素 6 (Ⅱ 6 )ｍＲＮＡ的表达高低 ,与临床疾病有极为密切的关系。目前定量检测ＩＬ 6ｍＲＮＡ主要采用实时聚合酶链反应 (ＰＣＲ)方法 ,但该方法需要实时ＰＣＲ仪和昂贵的荧光标记探针[1] 。本研究建立的逆转录 (ＲＴ)ＰＣＲ 酶联夹心杂交方法 ,能灵敏、特异、精确、简便地对人ＩＬ 6ｍＲＮＡ进行半定量分析。一、材料和方法1.主要试剂 :ＲＴ ＰＣＲ体系、链亲和素 辣根过氧化物酶结合物 (上海生工生物工程公司 ) ,ＤＮＡ结合微孔板 (ＣｏｒｎｉｎｇＣｏｓｔａｒ公司 ) ,杂交试剂自配[2 ] 。2 .引物、探针设计与合成 :( 1)引物序…     

SHV-4型ESBL在pET26b/BL(DE3)中的表达纯化及其特性研究

目的:表达SHV-4型超广谱β-内酰胺酶,对纯化的SHY-4酶进行特性研究.方法:将SHV-4基因克隆到pET26b表达质粒,重组质粒转入E.coli BL21(DE3)构建工程菌,重组工程菌经摇瓶发酵后获得种子菌,种子菌转入发酵罐发酵,当菌体密度OD600为0.8时,加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0 mmol/L,于37℃培养6 h.培养液离心收获菌体沉淀,其超声裂解上清液进行Ni2 亲和层析,获取的SHV-4酶进行分子量、纯度、等电点、最适条件、米氏常数、催化常数等特性进行分析.结果:SDS-PAGE电泳,等电聚焦电泳及系列的酶动力学实验表明SHV-4酶分子量约为30 kD,纯度大于95%,等电点为7.9,最适pH值为6.0～8.0,最适温度为37℃,以头孢硝噻吩为底物测定的Km值为2.61×10-6 mol/L,Kcat为258 s,Kcat/Km为9.88×107 mol-1·s-1·vL.结论:重组的SHV-4酶初步满足制成商品酶的条件.     

细脚拟青霉多糖体外抗肿瘤作用及其机制的实验研究

目的：通过观察细脚拟青霉多糖的体外抗肿瘤活性，初步探讨其作用机制。方法:采用水提，乙醇沉淀，DEAE-纤维素和Sephadex G-100柱层析分离纯化多糖PTPS-I；以PTPS-I 和经PTPS-I刺激培养的人外周血单个核细胞(MNC)的条件培养基(PTPS-I-MNC-CM)作用于体外培养的红白血病细胞K562、喉癌细胞Hep2和肝癌细胞SMMC-7721，观察PTPS-I 和PTPS-I-MNC-CM对其增殖活性的影响；用cell counting kit-8 (CCK-8)检测MNC 的增殖活性；以荧光定量PCR检测MNC 中TNF-α和IL-6 mRNA的表达。结果:PTPS-I-MNC-CM能抑制K562，Hep2和SMMC-7721细胞的增殖(均为P＜0.01)；PTPS-I不能抑制肿瘤细胞的增殖(P＞0.05)，没有显现直接的细胞毒作用。PTPS-I能促进MNC的增殖(P＜0.01)和增强TNF-α 和 IL-6 mRNA的表达(P＜0.05，P＜0.01)。结论:PTPS-I具有免疫调节活性，通过免疫调节发挥抗肿瘤作用。