IGF-Ⅰ对破骨细胞骨吸收的促进作用依赖于成骨细胞的协同

目的 探讨胰岛素样生长因子Ⅰ (IGF-Ⅰ)对破骨细胞骨吸收的促进作用是否需要成骨细胞的协同.方法 体外培养MC3T3小鼠成骨细胞及NF-κB受体的配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)诱导分化成熟的破骨细胞,分别给予重组人胰岛素样生长因子Ⅰ(rhIGF-Ⅰ)进行干预,Western印迹检测IGF-Ⅰ受体的活化情况.以0、10 ng/ml的rhIGF-Ⅰ直接干预破骨细胞或与成骨细胞在Transwell双层培养板中共培养的破骨细胞,MTT法测定破骨细胞增殖;流式细胞仪检测破骨细胞凋亡率;实时PCR检测组织蛋白酶K基因的表达.将不同方式干预的破骨细胞接种在骨磨片上,光镜观察骨吸收陷窝的形成.结果 在成骨细胞、破骨细胞表面均检测到可被IGF-Ⅰ激活的IGF-Ⅰ受体.仅在成骨细胞、破骨细胞共培养时rhIGF-Ⅰ能够促进破骨细胞活细胞的增殖(P＜0.05);抑制破骨细胞的凋亡(P＜0.05);上调组织蛋白酶K基因的表达(P＜0.05);增加骨吸收陷窝的数量及面积.IGF-Ⅰ对单独培养的破骨细胞则作用不明显.结论 IGF-Ⅰ对破骨细胞骨吸收的促进作用需要成骨细胞的协同.     

microRNA-140真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建miR-140真核表达载体并检测其在兔软骨细胞中的表达情况。方法 以人全血标本基因组为模板,PCR扩增出带有酶切位点的miR-140序列,将该序列定向克隆入pBudCE4.1载体中,构建pBudCE4.1-miR-140真核表达载体。将核定位信号肽偶联核激酶底物短肽（nucleus localization signal linked nucleic kinase substrate short peptide,NNS）修饰的壳聚糖（^NNSCS）分别与pBudCE4.1-miR-140重组质粒及pBudCE4.1空质粒形成纳米复合物,分别瞬时转染体外分离培养的正常兔原代关节软骨细胞,实时荧光定量PCR方法检测miR-140的表达情况。结果 构建的pBudCE4.1-miR-140真核表达质粒酶切鉴定和测序结果均正确,表明miR-140成功克隆入pBudCE4.1载体中。实时荧光定量PCR结果表明,与^NNSCS/pBudCE4.1对照组相比,^NNSCS/pBudCE4.1-miR-140转染组软骨细胞中miR-140表达升高约14.5倍（P<0.05）。结论 成功构建了pBudCE4.1-miR-140真核表达载体,瞬时转染后软骨细胞可以有效地高表达miR-140,为将来探究miR-140在软骨损伤修复中的作用机制奠定了基础。     

形成性评价在临床生物化学检验教学中的应用

目的探讨形成性评价在临床生物化学检验教学中的应用。方法将我院医学检验学系医学检验技术专业2014级100名本科生作为对照组,采用传统终结性评价方法;将2015级97名本科生作为实验组,采用形成性评价方法。比较两组教学效果。结果实验组期末考试成绩为良好和中等的学生比例明显高于对照组。结论在临床生物化学检验教学中应用形成性评价,有利于学生对知识的掌握及应用,有利于提高课程教学质量。     

应用型人才素质教育与精品课程群建设

全面素质教育是现代教育的宗旨,精品课程群建设是医学精英教育的手段,现代应用型人才培养需要借助精品课程群建设,实现学生全面素质教育。     

破骨细胞对IGF-1诱导成骨细胞骨同化的促进作用

目的 探讨破骨细胞(osteoclast, OC)存在时IGF-1对成骨细胞(osteoblast, OB)活性的影响。方法 体外培养MC3T3小鼠成骨细胞及RANKL诱导分化成熟的破骨细胞。以10ng/ mL的rhIGF-1直接干预单独或与破骨细胞共育的成骨细胞, 并设空白对照组,培养12h,检测成骨细胞的增殖、凋亡及碱性磷酸酶活性;培养8d后Von kossa钙化染色法观察矿化结节的形成。结果 成骨细胞、破骨细胞共培养时,rhIGF-1作用12h能够明显促进成骨细胞增殖(P<0.05),抑制成骨细胞的凋亡(P<0.05),使细胞内ALP活性升高(P<0.05),8d时钙化结节的个数及面积百分比升高(P<0.05);与单独培养的成骨细胞组有显著性差异。结论 破骨细胞可明显促进IGF-1所诱导的成骨细胞骨同化作用。     

破骨细胞参与时IGF-1对成骨细胞的促同化作用

目的探讨IGF-1对成骨细胞(osteoblast,OB)的促同化作用是否需要破骨细胞(Osteoclast,OC)的协同。方法体外培养MC3T3小鼠成骨细胞及RAW264.7小鼠单核巨噬细胞,RAW264.7细胞经核因子κB受体活化因子配基(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)诱导分化为破骨细胞。以50 ng/ml重组人胰岛素样生长因子-1(rhIGF-1)分别干预成骨细胞及分化成熟的破骨细胞,Wstern blotting验证IGF-1受体的活化。以0、10、50、100 ng/ml的rhIGF-1分别干预成骨细胞、破骨细胞及共培养的成、破骨细胞。12 h后终止培养,收集破骨细胞经IGF-1干预后的条件培养基(OC conditioned medium after IGF-1 treatment,OCCM)对另一组新接种的成骨细胞干预12 h。ELISA检测3组成骨细胞培基中骨钙素(bone Gla protein,BGP)、RANKL的含量,Real-time PCR检测成骨细胞中Bgp基因的表达。结果 RANKL诱导培养8 d后RAW264.7细胞形成TRAP阳性,成熟的多核破骨细胞;Wstern blotting检测表明rhIGF-1可有效得使成、破骨细胞中的IGF-1受体发生磷酸化;ELISA与Real-time PCR测定结果显示,IGF-1直接干预OB时,Bgp基因表达水平和培养基中BGP及RANKL蛋白的含量均与无干预的对照组无明显区别;而OCCM干预及共培养的OB组,当IGF-1初始干预浓度为10 ng/ml时BGP、RANKL含量及Bgp基因的表达水平显著提高,共培养组与OCCM培养组间无明显区别。结论 IGF-1对OB的促同化作用依赖于OC的参与,两种细胞间的联系可能是通过可溶性的细胞因子来完成。     

人防御素研究进展

自然界中存在一类具有抗菌作用的多肽,称为抗菌肽(antibiotic peptide).防御素(defensin)就是其中一类,人防御素(human denfensin,HD)是一类被研究的最广泛、不含糖链的碱性阳离子多肽,其主要存在于血液、肠道及表皮细胞中,具有广谱高效的杀菌作用和独特的作用机制,不易使微生物产生抗药性.     

可磷酸化底物肽促进基因转染效率的研究

目的进一步探讨可磷酸化碱性短肽提高短肽作为基因转移载体的转染效率。方法合成基序为LLL-RRRDNEY＊FY＊VRRLL的短肽（SP），以体外磷酸化实验观察哺乳动物细胞裂解液使SP磷酸化并促进SP／DNA复合物种DNA的释放。以荷荧光素酶报告基因的SP／DNA复合物转染C2C12细胞，观察转染效率。结果细胞裂解液可有效地使可磷酸化短肽发生磷酸化，并促进DNA与SP的解离。可磷酸化短肽对C2C12细胞的转染效率显著高于不可磷酸化短肽。结论可磷酸化短肽可以显著提高短肽的转染效率，外源DNA与SP载体在细胞内的解离情况对SP／DNA复合物的转染效率具有重要影响。     

从一根毛发中分别提取nDNA和mtDNA的简易方法

目的:探讨从1根脱落毛发中既获取核内基因组DNA(nDNA)又获取核外线粒体DNA(mtDNA)的简便可靠方法。方法:用含高浓度的二硫苏糖醇(DTT)的细胞裂解液裂解细胞,建立DTT-裂解液法及DTT-TKM法用于毛根、毛干部分的核酸提取,并对2种方法进行了比较。结果:2种方法均能从毛根及毛干中提取nDNA及mtDNA。DTT-TKM法适用于多根毛发的核酸提取。而DTT-裂解液法则不仅能提高毛囊DNA的提取量,而且能从少量毛干中提取到几乎不含nDNA的mtDNA。结论:DTT-裂解液法简便、经济、无创,更适于从1根毛发中分别提取nDNA及mtDNA。特别适用于血液等样本采集困难时对于遗传信息的获取,在法医学上亦具有一定的应用价值。     

可磷酸化短肽偶联壳聚糖介导兔关节软骨损伤修复的基因治疗

目的 探讨可磷酸化短肽(phosphorylatable short peptide,pSP)偶联壳聚糖(chitosan,CS)(pSP-CS),携载IGF-1和IL-1受体拮抗剂(IL-1 receptor antagonist,IL-1Ra)基因,局部转染促进关节软骨损伤修复的作用。方法构建pBudCE4.1-IL-1Ra、pBudCE4.1-IGF-1及pBudCE4.1-IL-1Ra+IGF-1质粒,以pSP偶联CS形成pSP-CS,将以上重组质粒分别与其复合形成pSP-CS/质粒DNA(pDNA)复合物。取3月龄健康雄性新西兰大耳白兔30只,体重2.0~2.5 kg,双侧后肢随机分为5组(n=12)。假手术组(A组)仅暴露股骨外侧髁关节面,pSP-CS/pBudCE4.1干预组(B组)、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra干预组(C组)、pSP-CS/pBudCE4.1-IGF-1干预组(D组)、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra+IGF-1干预组(E组)制备膝关节外侧髁软骨缺损模型。术后1周,各干预组给予对应pSP-CS/pDNA复合物,共7周;A组注射等量生理盐水。术后观察动物一般情况,8周时处死实验动物,取关节腔灌洗液ELISA分析IL-1Ra及IGF-1含量;实时荧光定量PCR检测缺损区软骨组织聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,MMP-3)、MMP抑制剂1(MMP inhibitor 1,TIMP-1)mRNA表达;阿尔辛蓝-过碘酸雪夫(alcian blue-periodic acid/schiff,ABPAS)染色及Aggrecan免疫组织化学染色鉴定损伤区新生细胞的软骨细胞表型,分析Aggrecan染色吸光度(A)值。结果实验动物术后无感染及死亡。各干预组关节腔灌洗液中检测到大量外源蛋白IGF-1和IL-1Ra,其中D、E组IGF-1含量以及C、E组IL-1Ra含量显著高于A组(P<0.05)。E组Aggrecan和TIMP-1 mRNA表达上调,MMP-3 mRNA表达下调,明显优于C、D组(P<0.05)。C、D、E组缺损处出现不同程度软骨性修复,AB-PAS染色及Aggrecan免疫组织化学染色均为阳性,且E组作用明显优于C、D组(P<0.05);B组缺损处仅被大量纤维组织增生和炎性细胞浸润,未见明显软骨性修复。结论 pSP-CS是一种较理想的基因载体,可携载治疗基因有效进入兔关节软骨组织;IL-1Ra与IGF-1协同作用明显促进损伤软骨修复。