常规免疫联合脾内免疫制备单克隆抗体

目的：探索一种新的简便有效的应用微量抗原使脾细胞产生免疫反应,制备单克隆抗体的实用方法。方法：在常规方法初次免疫后,用脾内直接注射法进行冲击免疫,只用微量的抗原就使Balb/c小鼠的脾细胞在短时间内产生免疫反应。结果：经细胞融合和ELISA筛选后,成功获得一株抗人PF4单克隆抗体（SZ－95）,抗体亚型IgG1,Western blot证实其特异性识别人血小4因子。结论：常规免疫结合脾内免疫是制备抗低分子量保守蛋白质单抗的有效方法。     

酶联免疫法测定vWF瑞斯托霉素辅因子

血管性血友病（von Willebrand disease，vWD）是一种最常见的遗传性出血性疾病，是由于血浆中血管性血友病因子（vWF）质或量的异常所致。vWF在高剪切力情况下，通过其A1区和A3区分别与血小板膜糖蛋白（GP）Ib／Ⅸ／Ⅴ复合物和血管内皮下胶原结合，介导血小板黏附过程。瑞斯托霉素辅因子活性（vWF：Rcof）测定是检测vWF的功能性试验，目前主要运用智能血小板凝集仪测定，我们建立了一种快速、简便的检测vWF：Rcof的ELISA实验方法，     

抗纤维蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

用XL-FN颗粒、D-D、FN单体等作为免疫原获得一组小鼠单克隆抗体。除了3个与FG有交叉反应,其余均只与XL-FN和/或其片段反应。其中SZ-58、SZ-60及SZ-63与血浆凝块的结合反应不受血浆或全血影响。在免疫印迹电泳中,SZ-63主要识别D-D,而SZ-58不识别任何区带。SZ-58、SZ-60可抑制血浆凝固,并对ADP诱导的血小板聚集有程度不同的抑制作用。SZ-60可与固相化的FG结合而与溶解态的FG无结合反应。结果提示,SZ-58、SZ-60、SZ-63对XL-FN反应的特异性较高,因此可应用于体内血栓显像而SZ-63同时又可应用于D-D检测。     

血管性血友病因子在ABO血型个体中质和量差异的实验研究

目的比较血管性血友病因子在ABO血型中质和量的差异。方法运用ELISA法同时测定A血型、B血型、AB血型及O血型四组正常人的vWF抗原水平(vWF:Ag)、VWF瑞斯托霉素辅因子活性(vWF:Rcof)及vWF胶原结合试验(vWF:CBA),并应用统计方法比较不同血型之间结果的差异。结果O型血个体其vWF:Ag、vWF:Rcof及vWF:CBA均低于非O型血,差异有显著统计学意义(P<0.001);同时,vWF:CBA下降水平大于vWF:Rcof,使得vWF:CBA/Ag(P<0.001)小于vWF:Rcof/Ag(P值为0.84)。结论O型血较非O型血个体有更高的出血危险,在临床诊断vWD的过程中要充分考虑ABO血型系统对血浆vWF水平的影响。     

严重肺挫伤患者血浆vWF因子的动态变化及其临床意义

目的通过检测严重肺挫伤患者血中血管性假血友病因子(vWF)在受伤后不同时点的含量,揭示其动态变化规律及对病情变化和预后的影响。方法将63例严重肺挫伤患者根据ALI/ARDS诊断标准分成ALI/ARDS组(A组)和非ALI/ARDS组(B组)两组,并引入对照组(C组),使用ELISA法分别检测伤后24h内、第3天、第5天、第7天时的血浆vWF水平,观察其动态规律,并比较各组的临床结果。结果严重肺挫伤ALI/ARDS组血浆vWF含量呈动态变化,发病后即升高,且各时段逐渐升高;严重肺挫伤非ALI/ARDS组血浆vWF含量亦呈动态变化,发病后先升高后降低;严重肺挫伤ALI/ARDS组后期死亡率明显增加。结论严重肺挫伤血浆vWF含量呈动态变化,动态血浆vWF水平可以作为严重肺挫伤后ARDS的预测及预后指标。     

P—选择素时间分辨荧光免疫分析法的建立及临床应用

目的　建立时间分辨荧光免疫分析法 (TRFIA)用于检测血栓形成相关疾病患者的血浆P 选择素的含量 ,并探讨其临床意义。方法　用抗人血小板单抗SZ 5 1 IgG包被 ,将Eu3+ N (对 异硫氰酸苄基 ) 二乙烯四乙酸与另一个血小板单抗S12连接以制备Eu3+ S12示踪剂 ,β 二酮为发光增强剂 ,采用平衡饱和法建立时间分辨荧光免疫分析法 (TRFIA)用于分析糖尿病、高血脂、脑梗塞患者及正常人血浆中P 选择素含量的变化 ,并与流式细胞术 (FCM)和酶标记免疫吸附分析法 (ELISA)作比较。结果　方法灵敏度为 0 98ng/ml,批内和批间CV分别为 4 2 3 %和 6 6 7% ,平均回收率为 97 2 4% ,可测范围为 4 1～ 80ng/ml。应用TRFIA测定 2 2例高血脂、18例脑梗塞患者和 2 0例正常人血浆中P 选择素含量 ,分别为 8 0 8± 1 4ng/ml,12 5 1± 3 6ng/ml和19 0 4± 7 9ng/ml,显著高于正常人 (3 0 7± 1 6 4ng/ml) (P <0 0 1)。同时与ELISA和FCM方法检测血浆内P 选择素和血小板膜表面表达情况作比较 ,结果一致。结论　TRFIA检测血浆P 选择素的方法可靠、灵敏、方便 ,具有较高的临床使用价值     

二位点酶联免疫测定血浆P-选择素方法的建立及临床意义

血小板活化与血管内皮细胞损伤在动脉血栓形成中起着重要的作用。P-选择素是血小板α-颗粒膜蛋白,它在血小板活化和释放过程中随着α-颗粒膜与血小板浆膜的融合暴露在血小板表面,成为体内血小板活化和血栓形成的特异标志。P-选择素有两种形式,其一是具有跨膜区域的整合型,另一种为缺乏跨膜区的游离型,后者在血小板活化时,释放到血浆内,成为血浆P-选择素的主要来源。因此,测定血浆内P-选择素的浓度变化,对体内血小板活化及血栓形成亦具有重要诊断价值。我们利用二株抗P-选择素的单克隆抗体,建立了双克隆抗体二位点酶联免疫测定血浆内P-选择素的方法,并测定了正常人和某些血栓性疾病病人血浆内P-选择素的浓度,为血栓性疾病的诊断提供了一个新的方法。     

阻断血管性血友病因子与胶原结合的抗人vWF-A3单抗的鉴定和功能研究

目的 制备阻断血管性血友病因子(von Willebrand因子)A3区(vWF-A3)与胶原结合的抗vWF-A3单抗,并对其进行生化鉴定和功能研究.方法 用重组vWF-A3蛋白免疫BALB/c小鼠,经标准的方法制备单抗.用ELISA法鉴定单抗特异性,经vWF胶原结合抑制试验筛选获得抑制性单抗,用免疫印迹技术确定单抗与重组(r)vWF-A3和还原性人vWF识别的抗原分子.经胶原结合试验确定单抗对vWF与胶原结合的影响.结果 获得一组共30株抗vWF-A3单抗,其中两株确定为抑制vWF与胶原结合的单抗,分别命名为SZ-123和SZ-125,两株单抗分别与rvWF-A3和vWF强反应,而不与rvWF-A1、A2反应.免疫印迹分析显示SZ-123和SZ-125分别识别相对分子质量为27×103的rvWF-A3、250×103还原性人vWF单体和170×103的vWF酶切片段.单抗SZ-123和SZ-125不仅剂量依赖性地抑制纯化的人血浆vWF与人胎盘和牛皮肤Ⅲ型胶原结合,而且分别抑制人、猕猴或Beagle犬血浆vWF与人胎盘和牛皮肤Ⅲ型胶原结合.结论 抗vWF-A3单抗SZ-123和SZ-125是两株抑制性单抗,有望成为具有治疗潜力的抗血栓药物.     

人血小板膜糖蛋白功能测定的酶联免疫分析方法的建立

目的建立测定血小板膜糖蛋白（GP）功能的酶联免疫分析（ELISA）方法 ,并对其灵敏度、批内和批间差异进行方法学考核。方法以抗血小板CD62P单抗SZ51和抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）单抗7E3分别包板,加入经ADP诱导的或未诱导的正常人富含血小板血浆（PRP）,以生物素标记的抗GPIb单抗SZ2（Biotin-SZ2）反应后,加入亲和素标记的辣根过氧化物酶（Avdin-HRP）检测,邻苯二胺（OPD）显色后,酶标仪读取吸光度（A）值。对其灵敏度及批内、批间差异作方法学评估,应用该方法对抑制性单抗SZ-21和阿司匹林抑制血小板活化的功能效果进行测定,并与流式细胞术（FCM）测定结果进行比较。结果该方法可检测血小板计数低达6.25×109/L（SZ51包被板）和3.13×109/L（7E3包被板）的标本,批内和批间变异系数均小于10%。测得50名健康正常人ADP诱导的（未诱导的）血小板的CD62P和GPⅡb/Ⅲa的A值分别为0.68±0.21（0.18±0.09）和0.87±0.29（0.44±0.14）。ELISA测定结果表明,SZ21和阿司匹林可明显抑制ADP诱导的血小板功能。流式细胞仪测定ADP诱导的（未诱导的）人血小板表面CD62P和GPⅡb/Ⅲa的阳性细胞百分率分别为（60.1±7.12）%[（2.56±0.61）%]和（86.32±17.82）%[（20.25±14.56）%],其批内和批间变异系数均〈10%。结论该方法可以测定血小板功能活化剂或抑制剂对血小板功能的影响,可以测定血栓性疾病或血栓形成相关性疾病引起的血小板活化程度。     

BA-ELISA定量检测人血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa、CD62p的表达及其临床应用

目的建立测定血小板膜糖蛋白功能的生物素亲和素酶联免疫吸附（BA-ELISA）方法,并探讨其临床应用价值。方法采用抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）单抗7E3和抗血小板CD62p单抗SZ51及生物素亲和素系统建立BA-ELISA方法,并应用该方法检测50名健康志愿者、30例急性心肌梗死（AMI）、30例急性脑梗死（ACI）和30例糖尿病（DM）患者的血小板膜糖蛋白功能,并与流式细胞术（FCM）测定结果进行比较。同时,应用该方法对抑制性单抗SZ21和阿司匹林抑制血小板活化的功能效果进行测定。结果该方法检测血小板计数敏感度低达3.13×109/L（7E3包被板）和6.25×109/L（SZ51包被板）,批内和批间变异系数分别为6.23%～8.35%和4.38%～5.78%。测得AMI、ACI和DM患者ADP诱导的（未诱导的）血小板的GPⅡb/Ⅲa和CD62p表达量均显著高于健康志愿者（均P〈0.01）。BA-ELISA测定表明,SZ21和阿司匹林可抑制ADP诱导的血小板功能（但P〉0.05）。该方法和FCM同时测定健康志愿者、AMI、ACI和DM患者的GPⅡb/Ⅲa和CD62p表达水平。测定数据经直线回归分析得r=0.86。结论 BA-ELISA检测血小板的膜糖蛋白,可精确判断血小板的功能状态,为指导临床预防、诊治、评估疾病提供简便、可行的方法。活化的血小板膜糖蛋白测定可从凝血的角度对上述疾病的早期诊断、病情进展的判断、抗血栓药物的评估及疾病预后的判断起到辅助作用。