体外培养制备促甲状腺激素单抗及应用

目的探讨应用体外培养法代替传统的体内法小鼠腹水制备单克隆抗体,制备促甲状腺激素检测试剂盒。方法应用中空纤维系统体外培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体,制备甲状腺激素检测试剂盒,检测其效价、灵敏度、特异性。500份临床体检血清进行临床符合率检测,并与应用体内制备单克隆抗体在产试剂盒进行各项性能指标比较。结果中空纤维培养TSH杂交瘤细胞株其抗体分泌量达到1.5 mg/ml,纯度90%以上。采用同一批次辅料,酶结合物效价由体内法1/3 000提升到体外法1/4 000,建立检测方法的灵敏度为0.005μIU/ml~0.011μIU/ml,非特异性干扰低于0.05μIU/ml,剂量-反应曲线r2≥0.990,与罗氏和体内法在产试剂盒进行临床符合率比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论体外培养制备单克隆抗体可以代替小鼠腹水制备单克隆抗体,用于TSH体外诊断检测,具有重要的应用价值。     

人鼠嵌合HSV-Ⅰ IgG重组抗体的瞬时表达优化及应用

采用人肾上皮细胞(HEK293F)作为宿主细胞,体外表达单纯疱疹病毒(HSV)人鼠嵌合重组抗体,优化转染表达条件,并利用5L生物反应器进行放大培养.对纯化后的HSV-Ⅰ IgG抗体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和酶联免疫吸附试验以确定蛋白表达水平与免疫反应性.结果 显示,成功制备出相对分子质量为150000的重组IgG...     

CA50靶向抗体文库的构建筛选及应用评价

目的 获得针对CA50靶点的高亲和力、高特异性抗体,建立体外诊断CA50检测试剂盒,提高肿瘤诊断的特异性和灵敏度。 方法 PCR 技术获得单链抗体( ScFv)基因并克隆入pcomb3XSS噬粒载体,通过电转化获得ScFv噬菌体抗体库。用CA50特性识别表位LST a(唾液酸化-乳糖-N-四糖a)的抗原淘洗筛选,获得针对CA50靶点的特异性抗体基因序列。随机挑选克隆测序,验证ScFv抗体库的多样性。利用重叠PCR技术获得人鼠嵌合抗体基因,经过抗体表达纯化及配对筛选建立双抗体夹心法CA50检测试剂盒。同时收集临床诊断阳性样本54例和临床阴性对照样本146例,利用该研究建立的CA50检测试剂盒与罗氏CA50试剂盒进行平行对照,评价其检测相关性。 结果 建立噬菌体抗体库的容量为2.5×10⁸,具有较好的多样性。24个PCR鉴定阳性克隆测序,结果为20个正确插入且插入序列均不相同。经过3轮淘洗筛选出5个阳性克隆,经过抗体配对筛选建立的CA50试剂盒临床样本检测结果与罗氏的临床相关性(r=0.98)。 结论 通过噬菌体展示抗体库技术成功筛选出了针对CA50的高特异性、高亲和力抗体,为CA50检测在相关肿瘤辅助诊断中的应用提供可能性。     

哺乳动物细胞CHO制备重组抗体关键技术研究进展

哺乳动物细胞能够提供复杂的翻译后修饰,表达蛋白性质与天然蛋白接近,使蛋白药物更加稳定有效.自 1987 年 FDA 批准第一个中国新药组织型纤溶酶原激活剂(TPA),哺乳动物细胞广泛应用于重组蛋白的生产,开始了工业化生产之路.在生物制药行业几十年的快速发展中,哺乳动物 CHO 细胞成功生产了众多细胞因子、重组酶、重组抗...     

人性激素结合球蛋白的真核表达、纯化鉴定及质控品应用分析

目的 构建人性激素结合球蛋白(SHBG)的重组真核表达载体,获得高纯度的人SHBG重组蛋白.方法 根据人SHBG基因序列,利用Primer Premier 6.0设计引物,扩增获得人SHBG基因;构建人SH-BG-pCMV3H重组真核表达载体;将其转染至HEK-293F细胞,提取人SHBG重组蛋白,并用ConA柱亲和层析法纯化;采用人S HBG检测试剂盒对其蛋白浓度进行鉴定.结果 人S HBG基因产物长度与预期一致,约为1200 bp;测序比对分析结果显示人SHBG基因成功插入pCMV3H载体;电泳结果显示在相对分子质量约为42×103处有一明显条带,与预期蛋白质位置一致;人SHBG检测试剂盒鉴定结果显示人SHBG重组蛋白作为质控品与西门子、安图生物、罗氏一致性良好;含钙离子缓冲液中人S HBG重组蛋白稳定性优于不含钙离子缓冲液.结论 真核表达人SHBG重组蛋白能够作为SHBG检测试剂的质控品,且各厂家检测一致性良好;钙离子有利于提升人SHBG蛋白的稳定性.     

不同操作环境对4种TB-IGRA检测试剂盒的影响

<正>结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的慢性传染性疾病。早期明确诊断并进行治疗可明显降低结核病患者的病死率。快速、准确、敏感、特异且简便的诊断方法是有效控制结核病蔓延的关键。T细胞γ干扰素体外释放试验(TB-interferon gamma release assay,TB-IGRA)是一种以T细胞检测为基础的MTB试验,与目前主要的检测     

重组表达HIV不同亚型gp41蛋白的抗原表位暴露情况分析

目的通过化学发光法检测原核重组HIV I型4种不同亚型gp41膜外区蛋白对阴阳性标本的反应性,间接反映重组表达gp41膜外区蛋白的抗原表位暴露情况,为科研、临床异常标本分析提供分析方法。方法选取HIV I型4个国内主流基因型(BC、AE、B、C)膜外区序列,克隆至pGEX4T-3载体中,优化目标蛋白的纯化工艺,制备出HIV I型gp41膜外区相应蛋白作为包被抗原,与商品化gp41-HRP酶结合物配对后,夹心法进行HIV I型阴阳性标本反应性的测试,从而判断相应蛋白抗原表位暴露情况。结果HIV I型4个亚型的gp41膜外区相同区段在pGEX4T-3原核载体中均能表达出符合预期大小的目的蛋白;纯化后分别作为包被抗原,按相同浓度包被后进行HIV I型阴阳性标本的测试,结果显示不同亚型的gp41表达蛋白与商品化gp41-HRP酶反应性存在较大差异。结论通过原核表达系统高效表达了HIV I型主流亚型gp41膜外区蛋白,化学发光法组建夹心法进行阴阳性标本测试,其反应性不一致,间接反映出不同基因型选取同一表达区域进行体外重组表达其结构折叠方式有区别,此研究为HIV科研、临床标本验证等提供了基础。