信号肽与猪链球菌GDH融合的DNA疫苗构建及体液免疫研究

目的 设计、构建猪链球菌GDH真核表达载体并研究DNA疫苗免疫小鼠的体液免疫.方法 在猪链球菌保护性抗原GDH基因5'末端引入人IL-2信号肽序列,通过PCR进行拼接,得到的融合DNA片段经过酶切克隆入质粒pcDNA3.0,构建核酸疫苗重组质粒pcDNA3.0-gdh.通过肌肉注射途径将重组质粒pcDNA3.0-gdh免疫小鼠,经ELASA实验和Western blot进行检验.结果 构建的表达载体在小鼠体内表达出正确的目的 蛋白,能诱导体液免疫.结论 构建的DNA疫苗能够引起体液免疫,为研究猪链球菌核酸疫苗提供分子工具.     

猪链球菌2型谷氨酸脱氢酶基因的克隆表达及酶活性测定

目的克隆表达猪链球菌谷氨酸脱氢酶(GDH),并测定其酶活性。方法设计引物采用PCR法自海安病人分离株Habb基因组扩增GDH的编码基因gdh,进行序列分析;构建重组表达质粒pGEX4T-2-gdh,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,PAGE检测;通过亲和层析纯化,获得融合蛋白GST-GDH,用凝血酶剪切去除GST,获得完整的GDH纯化蛋白后测定其酶活性。结果PCR法自猪链球菌菌株Habb基因组扩增出约1.3kb的目的片段;序列分析显示猪链球菌的GDH具有GDH蛋白家族I的典型保守序列;体外构建筛选原核表达质粒pGEX4T-2-gdh,诱导重组体,表达的蛋白经PAGE初步测定其相对分子质量(Mr)约为71×103;用凝血酶酶切去除融合蛋白中的GST标签后得到的蛋白相对分子质量为45×103;GDH活性测定显示猪链球菌GDH利用α-酮戊二酸做底物,用NADPH做辅酶催化氨的同化和谷氨酸的合成。结论克隆并表达出猪链球菌GDH;猪链球菌GDH属于GDH蛋白家族I,是NADP(H)-特异性GDH。     

2型猪链球菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogen-ase,GDH）的单克隆抗体。方法分别以2型S.suis全菌细胞和重组GDH蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠;采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合;酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株并克隆化;免疫印迹（Western blot）鉴定GDH单克隆抗体的特异性;制备小鼠腹水并进行抗体效价测定。结果细胞融合后经ELISA筛选获得分泌的阳性细胞株,经过有限稀释克隆化筛选,获得4株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单抗腹水的抗体效价均在1∶102400以上。结论本研究获得了4株能稳定分泌抗体且其分泌的抗体能够与GDH蛋白进行特异性反应的单克隆抗体细胞株,所获得特异性单克隆抗体能用于猪链球菌结构和功能的研究,也能够进一步用于猪链球菌感染血清学诊断方法研究。     

宫腔球囊手术联合卡前列素氨丁三醇在产后止血中的应用

目的 探讨卡前列素氨丁三醇注射液联合宫腔球囊在一线治疗无效顺产产后出血中的治疗效果。方法 选择2020年1月至2023年1月本院收治的52例顺产产后出血患者,按治疗方法分为观察组、对照组,各26例。对照组采用宫腔球囊治疗,观察组在对照组基础上,联合卡前列素氨丁三醇注射液治疗。比较两组围术期情况、治疗前、治疗24 h后红细胞计数（RBC）、红细胞压积（Hct）、血小板计数（PLT）、血红蛋白（Hb）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、纤维蛋白原（FIB）的变化及不良反应发生率。结果 观察组产后2 h出血量、2～24 h出血量、血性恶露持续时间、住院时间分别为均少于/短于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;治疗后,观察组RBC、Hct、PLT、Hb均高于对照组,APTT、PT、FIB均短于/低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;两组不良反应总发生率分别,比较无统计学意义（P>0.05）。结论 卡前列素氨丁三醇注射液联合宫腔球囊在一线治疗无效顺产产后出血中的治疗效果明显。     

gdh基因在猪链球菌中的分布及重组GDH的抗原性研究

目的了解谷氨酸脱氢酶基因(gdh)在不同血清型猪链球菌(S.suis)中的分布情况,分析重组谷氨酸脱氢酶(GDH)的抗原性,为其应用于S.suis感染诊断和疫苗研究提供实验数据。方法应用PCR方法检测不同血清型S.suis中的gdh;利用45 kD重组GDH制备多克隆抗体,Western blot方法分析S.suis各血清型菌株与多克隆抗体的反应以及实验感染S.suis2型的猪血清与重组GDH的反应情况。结果在S.suis35个血清型标准株中,除了22、26、27、29、32及34型以外,其余包括1、2、1/2、7、9和14型在内的29个血清型、61株国内外S.suis2型分离株全部扩增出目的条带。用重组GDH免疫小鼠,在小鼠血清中均检测到抗GDH的抗体;Western blot结果显示,全部被检菌株与抗GDH血清反应均有单一特异性反应条带,6份实验感染猪血清均能与重组GDH产生反应条带。结论重组GDH具有免疫原性和反应原性,该蛋白有可能作为建立诊断试验的候选抗原,为进一步开展相关的血清学诊断方法和疫苗研究奠定基础。