PFP、GrB的共表达杀伤人喉癌Hep-2细胞的体外研究

为探讨穿孔素(PFP)、颗粒酶B(GrB)共表达对人喉癌(Hep-2)细胞生长的抑制及其诱导该细胞的凋亡作用,采用RT-PCR的方法从人的喉癌组织浸润淋巴细胞中扩增全长PFP、GrB的cDNA片段,构建共表达重组体pVAX1-PIG,并将其转染入人的Hep-2细胞株中。收集转染后的Hep-2细胞,采用软琼脂集落形成实验、MTT法、原位末端标记法(TUNEL)、流式细胞仪(FCM)检测分析各组人Hep-2细胞的生长抑制及其凋亡情况。结果显示pVAX1-PIG转染组的集落形成数目比空白对照组与pVAX1转染组明显减少(P<0.05),MTT检测结果显示对照组细胞生长速度比pVAX1-PIG转染组要快。TUNEL染色、FCM法检测均显示pVAX1-PIG转染组的Hep-2细胞大量凋亡且其凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。因此,PFP、GrB的共表达能够抑制人Hep-2细胞的生长并且可以诱导该细胞的凋亡。     

恙虫病东方体Karp株核酸疫苗的构建及其免疫功能初步研究

目的构建恙虫病东方体Karp株Sta56抗原候选核酸疫苗并初步探讨其可能诱导的免疫功能。方法从连有恙虫病东方体Karp株编码56000u表膜蛋白基因开放读码框全长的T载体质粒pMD18/Sta56中双酶切出目的基因,定向亚克隆构建核酸疫苗质粒载体pVAX1-Sta56,转染Hela细胞,WesternBlot分析Sta56蛋白的表达及其免疫原性,转染L929细胞,接种恙虫病东方体,Giemsa染色细胞内恙虫病东方体数目比较,初步探讨pVAX1-Sta56可能诱导的细胞免疫现象。结果pVAX1-Sta56连有正确读码框架的Sta56全长基因。转染有pVAX1-Sta56的Hela细胞培养上清可检测到被兔抗恙虫病东方体Karp株抗血清识别的特异条带。转染有pVAX1-Sta56的L929细胞内恙虫病东方体数目显著少于转染pVAX1的L929细胞(P<0.01)。结论成功构建能够表达Sta56表膜蛋白抗原的核酸疫苗载体pVAX1-Sta56,并能诱导产生细胞免疫功能。     

RNA干扰诱导DNA修复基因hMGMT表达沉寂的研究

背景与目的：构建能特异诱导人DNA修复基因hMGMT表达沉寂的RNA干扰载体。材料与方法：通过两步法聚合酶链反应（Polymerasing chain reaction,PCR）扩增hMGMT特异RNA干扰表达盒,连入质粒载体构建RNA干扰质粒pU6-MGMTi,与pGEFP-C1共转染人支气管上皮16HBE（Human bronchial epithelial）细胞,G418筛选后,采用RT-PCR和Westem Blot分别检测mRNA和蛋白水平的表达抑制情况。结果：成功构建hMGMT特异RNA干扰质粒pU6-MGMTi,转染16HBE细胞的mRNA和蛋白表达受到显著的抑制。结论：应用RNA干扰表达盒以及共转染技术,构建MGMT基因表达沉寂的细胞株,为进一步阐明MGMT基因的功能创造条件。     

恙虫病东方体Karp株56kD表膜蛋白基因的表达及免疫诊断应用研究

目的实现恙虫病东方体56kD表膜蛋白的原核表达并评价重组蛋白作为抗原的免疫诊断价值。方法亚克隆技术构建原核表达质粒载体pGEX-Sta56,转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-Sta56融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白,应用ELISA以评价其免疫诊断价值。结果pGEX-Sta56经测序鉴定Sta56基因以正确的表达框架连入载体,经过诱导表达得到正确大小的融合蛋白,应用纯化的GST-Sta56的ELISA检测结果与全细胞抗原有很高线性相关性,在小鼠血清检测中敏感性,特异性和准确性分别大于90%,70%和80%。结论成功表达重组的56kD表膜蛋白并可能替代传统的全细胞纯化蛋白,为建立快速、敏感和特异的免疫学诊断奠定了基础。     

人颗粒酶B基因的克隆、蛋白纯化及表达分析

TIL具有抗肿瘤的活性 ,其中颗粒酶B在杀伤肿瘤细胞的过程中起了最重要的作用。本实验拟扩增GrB全序列 ,构建GrB的原核表达载体 ,从而建立其原核表达体系 ,获得高效表达的重组GrB ,纯化蛋白。用淋巴细胞分离液分离肿瘤组织中的淋巴细胞 ,并抽提RNA ,RT PCR方法获得GrB的全长 ,并重组到pGEX 4T 1中 ,用限制性内切酶酶切和DNA测序法进行鉴定 ,IPTG诱导pGEX GrB转化的BL2 1菌 ,大量纯化表达产物 ,并通过SDS PAGE、Westernblot分析表达产物 ,用MTT法体外检测GrB对Hep2细胞的作用。结果 :限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实成功获得GrB基因片段 ,GrB准确克隆入pGEX 4T 1 ,成功的构建pGEX GrB ,经诱导表达出与GST融合的蛋白 ,经凝血酶酶切后获得与GrB相符的条带 ,并能与GrB特异性抗体结合。体外实验表明 ,GrB能抑制Hep2细胞的增殖。成功构建了pGEX GrB ,并成功表达、大量纯化GrB蛋白 ,其能够抑制Hep2细胞的增殖。     

恙虫病东方体感染免疫及其疫苗研究进展

恙虫病东方体是恙虫病的病原体，机体对恙虫病的免疫机制主要是细胞,抗体在恙虫病免疫中也起一定作用，目前尚无预防恙虫病的理想疫苗。     

癌基因高表达人上皮细胞转化模型的构建及应用

目的 构建癌基因高表达人支气管上皮细胞模型并应用于致癌物诱导细胞恶性转化活性的检测.方法 在永生化人支气管上皮细胞株16HBE中依次导入人端粒酶催化亚基(hTERT)、癌基因H-RasV12或c-Myc或空白载体,构建细胞株16HBETR、16HBETM和16HBETV.检测所构建细胞株的生物学特性如细胞形态、细胞生长、染色体畸变等指标.用已知致癌物硫酸镍(NiSO4)和二氢二醇环氧苯并(a)芘(BPDE)多次染毒,利用软琼脂试验及荷瘤试验检测化学物诱导细胞转化的活性.结果 经过端粒酶活性测定以及蛋白印迹验证上述转基因16HBE细胞株均构建成功.癌基因H-Ras和c-Myc的表达分别使细胞的增殖加速30.3%和10.4%,但是细胞染色体的畸变率没有发生改变.癌基因高表达细胞株只在软琼脂中形成少数背景克隆,但不能在裸鼠皮下形成肿瘤.BPDE诱导16HBETR、16HBETM细胞发生恶性转化的间期分别为5周、11周,比对照组细胞16HBETV的20周分别提前了15周和9周;而硫酸镍诱导16HBETR、16HBETM细胞转化的间期分别为11周、14周.比对照组细胞的32周分别提前了21周和18周.结论 癌基因高表达的细胞转化模型可大大缩短试验间期,有望应用于环境致癌物的筛查及化学致癌机制的研究.     

恙虫病东方体感染免疫及其疫苗研究进展

恙虫病东方体是恙虫病的病原体,机体对恙虫病的免疫机制主要是细胞免疫,抗体在恙虫病免疫中也起一定作用,目前尚无预防恙虫病的理想疫苗。     

苯并芘诱导细胞转化过程中PP2A B56ε表达与DNA损伤修复功能的研究

目的：探讨蛋白磷酸酶2A-B56ε亚基（PP2A B56ε,由PPP2R5E基因编码）的表达在苯并芘诱导细胞转化过程中对DNA损伤修复功能的影响。方法实时荧光定量-PCR（QRT-PCR）检测BEAS-2B细胞（人正常肺上皮细胞）、和BEAS-2BT细胞（苯并芘诱导恶变的人肺上皮细胞）中PPP2R5E的mRNA转录水平;免疫印迹法（Western Blot）检测细胞中 B56ε编码蛋白的水平;中性单细胞凝胶电泳实验（彗星实验,SCGE）检测喜树碱（ camptothecin,CPT）处理的细胞DNA断裂损伤及修复情况;免疫印迹法检测 CPT 处理诱导γH2AX（磷酸化组蛋白 H2AX）水平。结果与 BEAS-2B 细胞相比较,BEAS-2BT 细胞中PPP2R5E其mRNA水平及B56ε蛋白水平均显著高表达（P〈0.05）。与BEAS-2B细胞相比,经CPT处理恢复后,BEAS-2BT细胞尾距显著降低（P〈0.05）。表明BEAS-2BT细胞中H2AX的磷酸化水平明显降低。结论在苯并芘诱导细胞转化过程中PP2A B56ε通过介导γH2AX去磷酸化影响DNA损伤修复功能。     

快速筛选芳香烃受体基因特异RNA干扰序列的初步研究

目的筛选能诱导人芳香烃受体(AhR)基因表达沉默的特异RNA干扰片段。方法根据RNA干扰设计的原则,选择4个片段,用聚合酶链反应(PCR)方法,以含有人U6启动子的质粒为模板,分别扩增正义和反义小干扰RNA(siRNA)表达盒,纯化后直接转染人支气管上皮细胞(16HBE),抽提细胞总RNA,定量竞争逆转录PCR(RT-PCR)检测目的基因的mRNA表达差异,确定RNA干扰的效率。结果含AhR的干扰序列a493、a671、a1337和a1885的siRNA表达盒对AhR的mRNA表达抑制率分别为61.6%、-0.5%、78.6%和95.4%。结论运用PCR扩增siRNA表达盒从多个候选序列中快速筛选出芳香烃受体有效的干扰序列,为进一步的基因功能研究创造了条件。