2003年美国器官移植学会年会学术报道

美国器官移植学会(AST)2003年年会于5月30日～6月4日在华盛顿召开。现将大会主要议题及新进展介绍如下。     

小鼠CD4+CD25+T细胞的分离、鉴定和体外功能的检测

目的　建立CD4 CD2 5 T细胞的免疫磁性分离(MACS)方法,并检测其体外免疫抑制功能。方法　分离C5 7BL 6小鼠和Balb c小鼠脾脏细胞后运用MACS法分离CD4 CD2 5 T淋巴细胞,用台盼蓝染色法和流式细胞法检测选出细胞的活性和纯度,用淋巴细胞转化实验分析其免疫抑制功能。结果　MACS分选法分选出的CD4 CD2 5 T细胞活性>97% ,纯度>95 % ;此方法获得的CD4 CD2 5 T细胞在体外不增殖,经丝裂原活化后可以抑制同品系小鼠和异品系小鼠的CD4 CD2 5 -T细胞增殖,这种抑制作用具有剂量依赖性。结论　MACS法可简单迅速分选出高纯度无菌CD4 CD2 5 T细胞,且不影响细胞活力。CD4 CD2 5 T调节性细胞在体外具有免疫无能和免疫抑制作用;丝裂原活化的该细胞免疫抑制功能具有剂量依赖性,但不具有抗原特异性。     

TGF—β诱导的调节性T细胞体内输注延长小鼠皮肤移植物存活

利用TGF-β1体外诱导naYveT细胞分化为调节性T细胞（Treg）,通过体内输注延长小鼠皮肤移植物存活时间,并研究其相关机制。根据诱导条件不同分为3组：对照组（加入IL-2培养的C57BL／6小鼠T细胞）、MLR组（即混合淋巴细胞反应组,经同种抗原刺激活化的C57BL／6小鼠T细胞）和TGF-β组（经同种抗原刺激活化的C57BL／6小鼠T细胞,同时加入5．0ng／mlTGF-β1诱导）。利用FACS检测CD4＋CD25＋T细胞比例,并用RT—PCR检测Foxp3的表达水平。建立小鼠皮肤移植模型,并于第0、1、2和3天输注上述细胞,观察皮肤移植物存活时间。     

携带绿色荧光蛋白腺病毒经不同给药方式进入BALB/C鼠体内后的组织分布和代谢

目的 观察蕈组腺病毒分别经由尾静脉和腹膜后注射进入小鼠体内后的组织分布和代谢,探讨重组腺病毒载体与肝移植结合治疗肝癌的可行性和安全性.方法 分别采取尾静脉和腹膜后注射Adv-GFP建立动物模型,以绿色荧光蛋白(GFP)表达作为指示观察腺病毒的组织分布;用原佗杂交法比较各器官的腺病毒转录;定量检测注射后不同时间点血清和肝脏中的病毒滴度.结果 两种不同给药方式注射Adv-GFP入小鼠体内后,在基因转录与GFP表达上均显示Adv-GFP主要分布在肝、脾、肺和肾;腹膜后注射与尾静脉注射比较,肝组织内腺病毒转录与表达明显增多(P<0.05),而脾、肺和肾有不同程度的减弱;腹膜后沣射的腺病毒亦会短时内进入体循环,但肝组织的病毒滴度在1周内各个时间点均明显高于尾静脉途径.结论 重组腺病毒腹膜后注射能够优化治疗效果,并在一定程度上减少全身反应,更适于肝癌肝移植后的基因治疗.     

体外分化的CD4+CD25+调节性T细胞可减轻小鼠皮肤移植急性排斥反应

目的 利用转化生长因子-β 1(TGF-β 1)体外诱导CD4 +CD25 -T细胞分化为CD4 +CD25 +调节性T细胞,通过体内输注延长小鼠皮肤移植物存活时间,并研究其相关机制.方法 分选获取CD4 +CD25 -T细胞,根据诱导条件不同分为3组:对照组、无TGF-β 1刺激组和TGF-β 1组.检测CD4 +CD25 +T细胞比例,并用RT-PCR检测Foxp3 mRNA的表达水平.建立小鼠皮肤移植模型,于0、1、2、3 d输注上述细胞,观察皮肤移植物存活时间,并检测移植物的病理改变和受鼠外周淋巴细胞的增殖能力.结果 TGF-β 1组中CD4 +CD25 +T细胞比例与无TGF-β 1刺激组相近,但高表达Foxp3 mRNA(P ＜0.05).将培养的细胞输注给受鼠后发现,输注无TGF-β 1刺激组细胞的受鼠其移植物平均存活时间(mean survival time,MST)为(7.3±1.6)d,低于对照组(P ＜0.05);而输注TGF-β 1组细胞小鼠MST为(24.1±2.5)d,较对照组和无TGF-β 1刺激组明显延长(P ＜0.05).病理检测亦显示TGF-β 1组受鼠移植物结构完整,无明显淋巴细胞浸润.用Alamar Blue法检测受鼠外周淋巴细胞增殖活性显示,TGF-β 1组受鼠淋巴细胞增殖能力被明显抑制,低于对照组.进一步检测外周血中IL-4和IFN-γ的表达水平,结果显示TGF-β 1组小鼠体内IL-4和IFN-γ均明显低于对照组和无TGF-β 1刺激组.结论 TGF-β 1可诱导CD4 +CD25 -T细胞分化为CD4 +CD25 +调节性T细胞,将诱导后的调节性T细胞进行过继输注可延长小鼠皮肤移植物存活时间.     

重组小鼠Galectin-9在大肠杆菌中的表达以及体外功能检测

本研究旨在构建重组Galectin-9（半乳糖凝集素9）原核表达质粒，并对表达蛋白进行纯化和功能学鉴定。     

沙利度胺对小鼠皮肤移植的影响

目的观察沙利度胺对小鼠皮肤移植物存活及生长情况的影响,探讨沙利度胺在抗同种异体排斥反应中的作用。方法建立Balb/c小鼠到C57BL/6小鼠的皮肤移植模型,将模型小鼠随机分为3组,每组12只,对照组腹腔注射吐温-80溶液+0.9%氯化钠注射液(1∶999),200 mL.kg-1.d-1;环孢素A组腹腔注射环孢素A,10 mg.kg-1.d-1;沙利度胺组腹腔注射沙利度胺,200 mg.kg-1.d-1。分别于实验第7,9,11天取小鼠皮肤移植物进行病理检测,观察各组移植物平均存活时间。结果对照组小鼠移植物平均存活时间为8.2 d,环孢素A组平均为13.5 d,沙利度胺组平均为13.2 d,环孢素A组与沙利度胺组均明显高于对照组(P<0.05),环孢素A组与沙利度胺组之间差异无显著性(均P>0.05)。第7,9,11天各组移植皮片病理检测结果显示,随着时间的延长,各组均可见移植皮下淋巴细胞浸润,腺体及毛细血管破坏逐渐加重;其中对照组皮下组织破坏严重,沙利度胺组皮下组织破坏明显减轻,环孢素A组皮下组织破坏最轻。结论沙利度胺能延长Balb/c小鼠到C57BL/6小鼠皮肤移植物的存活时间,具有一定的临床应用前景。     

术前输注供者脾细胞联合应用西罗莫司延长小鼠移植心存活时间的机理

目的探讨移植术前输注供者脾细胞(DST)联合应用西罗莫司(SRL)延长小鼠移植心存活时间的机理。方法单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞及静脉输注的脾细胞均采用经丝裂霉素C处理后失去增殖活性的Balb/c(H-2~d)小鼠脾细胞(包括体外实验和体内实验)。(1)体外实验:分为3组,空白对照组:取正常C57BL/6(H-2~b)小鼠(B6小鼠)的脾细胞作为反应细胞;SRL组:取用SRL(1.5μl·g~(-1)·d~(-1))灌胃7 d后的B6小鼠脾细胞作为反应细胞;DST SRL组:取行脾细胞静脉输注8 d、次日予SRL(1.5μl·g~(-1)·d~(-1))灌胃7 d后的B6小鼠的脾细胞作为反应细胞。观察各组在单向混合培养中的脾细胞增殖能力。(2)体内实验:Balb/c小鼠为供者,B6小鼠为受者,建立颈部异位心脏移植模型。实验分为3组,空白对照组:单纯行心脏移植;DST组:受者移植前8 d给予供者脾细胞静脉输注;DST SRL组:受者移植前8 d给予供者脾细胞静脉输注,次日予以SRL灌胃7d(1.5μl·g~(-1)·d~(-1))。术后观察各组移植心的存活时间、病理表现、受者淋巴细胞中CD4~ CD25~ 调节性T细胞(Tr细胞)和凋亡细胞比例的改变及同种抗原刺激后增殖活性变化。结果体外实验中,DST SRL组反应细胞增殖活性平均为(13.76±2.81)%,明显低于空白对照组(28.14%±5.53%,P<0.05)。体内实验中,空白对照组、DST SRL组以及DST组移植心平均存活时间分别为(8.6±0.48)d、(35±14.4)d和(4.83±0.52)d,DST SRL组存活时间显著延长(P<0.05);流式细胞术(FACS)分析显示DST SRL组脾细胞中CD4~ CD25~ Tr细胞比例平均为(3.39±0.21)%,明显高于空白对照组(1.57%±0.3%,P<0.05)。结论移植术前输注供者脾细胞联合应用西罗莫司可通过清除同种反应性T细胞克隆,增加受者体内CD4~ CD25~ Tr细胞的比例,减低对同种抗原的应答能力,从而延长同种小鼠移植心存活时间。     

Galectin-9(Tim-3L)显著减弱小鼠移植排斥

目的 探究Galectin-9(即T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3 ligand,Tim-3L)的真核定位与功能,及其对同种异基因排斥反应的影响.方法 PCR扩增Galectin-9片段,插入到pEGFP-N1质粒,转染中国仓鼠卵巢癌细胞系(CHO)行G418筛选,分选增强型绿色荧光蛋白(EGFP)阳性细胞.免疫组化检测Galectin-9的表达,Alamar Blue法检测稳定转染Galectin-9的CHO细胞及其新鲜培养上清对脾细胞增殖的影响,ELISA检测IL-2水平.给予BALB/c→C57BL/6心脏移植受鼠Galectin-9蛋白100μg×7 d.结果 Galectin-9表达于细胞浆,稳定转染Galectin-9-EGFP的CHO细胞上清抑制淋巴细胞增殖和IL-2的产生.上述效应可被Tim-3-Fc融合蛋白逆转.Galectin-9干预的心脏移植物中位生存时间明显延长[(22.7±1.2)d,(7.2±0.4)d)].结论 真核细胞中Galectin-9可通过分泌形式负调节同种异基因免疫;Galectin-9有望成为新型的抗排斥药物.     

羧基荧光素乙酰乙酸在移植免疫研究中的应用

目的：介绍和探讨活体荧光示踪染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA—SE)在移植免疫研究中的应用及价值。方法：以不同浓度的CFDA—SE标记小鼠脾细胞用于体内外实验。标记Balb／c(H2^d)和C57BL／6小鼠(H2^b)脾细胞行混合淋巴细胞培养，流式细胞术观察标记细胞的增殖情况。Balb／c裸小鼠(H2^d)构建移植物抗宿主(GVHR)、宿主抗移植物(HVGR)模型；通过流式细胞术检测标记细胞在外周血及脾的增殖情况。结果：荧光显微镜观察到标记细胞。流式细胞术检测到标记细胞荧光强度出现倍减现象，表明细胞发生了增殖；无抗原刺激组荧光强度无明显变化，抗原刺激后24—72h标记细胞停留在脾，第3天后增殖细胞进入外周血液。结论：羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记技术可应用于体内、体外实验，有助于对细胞增殖及定位进行检测，在移植免疫实验研究中具有很高的应用价值。