小鼠胚胎干细胞源性肝细胞的培养体系及分选

背景：已证实细胞可以向肝细胞分化。目前的研究集中在诱导分化上，对分化的肝细胞进行分选和进一步扩增研究较少。 目的: 比较不同的培养体系对胚胎干细胞源性的肝细胞生长的影响。 设计：对比观察。 材料：ES-D3细胞由上海细胞生物学研究所丛笑倩教授提供。 方法：采用半固体培养D3小鼠胚胎干细胞系，形成胚胎体。将来源于18 d的胚胎体用胰酶消化为单个细胞，在胶原处理过的培养皿中贴壁2 h，分别采用Novastem培养体系、肝细胞培养液培养体系和普通培养体系培养3 d。前2种培养体系又各分为含去除肝脏小鼠血清、含正常小鼠血清和无血清组3组，普通的培养体系分为含正常小鼠血清和含体积分数为0.1的胎牛血清2组。每组细胞均加入20μg/L肝细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子。 主要观察指标：细胞计数法分析细胞的增殖率，反转录-聚合酶链反应检测白蛋白的表达以及有限稀释聚合酶链反应法半定量检测胚胎源性肝细胞的含量。 结果：①胚胎干细胞源性的肝细胞在不同的培养体系中，生长速度和肝细胞的含量不一样，在加有正常小鼠血清的Novastem培养基中，细胞增殖最快，在无血清的Novastem培养体系中，胚胎干细胞源性的肝细胞含量明显增高。②除了DMEM+体积分数为0.1的胎牛血清组未检测到外，其他组均检测到了白蛋白表达。③在无血清Novastem培养体系中，肝样细胞含量明显增多。 结论：无血清的Novastem培养体系能分选和扩增分化的肝细胞，提高肝细胞纯度。     

13-MTD通过激活MAPK途径和抑制Akt存活途径诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡

目的： 探讨侧链饱和脂肪酸13-甲基十四烷酸(13-MTD)诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用机制。方法：140 mg/L 13-MTD处理体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞和人乳腺正常细胞,采用流式细胞仪检测技术观察13-MTD对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响,免疫印迹法检测13-MTD处理后细胞内c-Jun氨基末端激酶(JNK）,p38, Fas 相关死亡结构域蛋白(FADD)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)等蛋白磷酸化变化。结果：流式细胞仪实验结果显示13-MTD能有效地诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡,但不引起正常人乳腺上皮细胞凋亡。免疫印迹检测显示经13-MTD处理后的人乳腺癌MCF-7细胞JNK和p38磷酸化蛋白明显增加,Akt磷酸化蛋白明显减少。结论：13-MTD是一个新的安全高效抗肿瘤药物,其作用机制可能是通过激活MAPK途径和抑制Akt存活途径来诱导肿瘤细胞凋亡。     

PC-3悬浮成球细胞中ABCG2表达及其对化学治疗耐药性的实验研究

目的：探讨人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3悬浮成球细胞中ATP结合盒膜转运蛋白G超家族成员2（ABCG2）的表达及其对化学治疗的耐药性。方法：体外无血清悬浮培养PC-3细胞,逆转录定量-PCR检测PC-3悬浮成球细胞中ABCG2 mRNA的表达,采用MTT法检测PC-3悬浮成球细胞对顺铂的耐药性,计算半数抑制浓度（IC50）,并与PC-3贴壁细胞作对比。结果：PC-3悬浮成球细胞可以在无血清培养条件下生存并形成悬浮细胞球,PC-3悬浮成球细胞中ABCG2 mRNA的相对表达水平是PC-3贴壁细胞的33．98倍（P〈0．05）,其IC50是PC-3贴壁细胞的4．26倍（P〈0．05）。结论：人PC-3悬浮成球细胞中ABCG2表达水平较高,该类细胞对化学治疗具有较强耐药性。     

前列腺癌干细胞分离方法的对比及筛选

背景：前列腺癌干细胞是前列腺癌复发侵袭的重要原因,目前研究难点在于前列腺癌干细胞分离技术效率较低。目的：探索高效地从人前列腺癌PC-3及LNCap细胞株分离前列腺癌干细胞的方法。方法：采用含血清贴壁培养法及无血清悬浮培养法培养PC-3及LNCap细胞株,然后利用流式细胞表面标记CD133及CD44检测两种细胞在不同培养条件下可获取前列腺癌干细胞的比例,同时采用诱导分化实验初步鉴定前列腺癌干细胞特性。结果与结论：PC-3及LNCap细胞能在添加生长因子的无血清培养基中形成悬浮细胞球,接种在含血清培养基后可以诱导分化为贴壁细胞;无血清培养组的CD44^＋/CD133^＋细胞比例：PC-3为0.59%,LNCap为1.71%,含血清培养组中的CD44^＋/CD133^＋细胞比例：PC-3为0.32%,LNCap为0.73%,其中LNCap细胞采用两种方法所获的CD44^＋/CD133^＋细胞均高于PC-3所获的的细胞（P〈0.05）,在两种细胞中无血清悬浮培养和含血清贴壁培养差异无显著性意义（P〉0.05）,但无血清悬浮培养周期长,获得细胞数相对较少,直接影响分选后肿瘤干细胞功能测定。因此可以证实含血清贴壁培养LNCap细胞较无血清悬浮培养法更能高效快捷的获取前列腺癌干细胞。     

从PC-3细胞中富集前列腺癌干细胞的实验研究

目的从PC-3人前列腺癌细胞中分离并富集前列腺癌干细胞。方法体外无血清悬浮培养PC-3细胞,通过传代更新、诱导分化验证PC-3悬浮成球细胞具有强增殖性、自我更新及分化潜能,实时荧光定量核酸扩增检测系统检测CD44和CD133mRNA的表达,流式细胞术检测CD44+CD133+细胞和侧群(SP)细胞比例。结果 PC-3成球细胞可以在无血清培养液(SFM)中生存并形成可以稳定传代的悬浮细胞球。PC-3成球细胞具有自我更新和分化能力,其前列腺癌干细胞标志物CD44和CD133mRNA的相对表达量分别是PC-3贴壁细胞的41.83倍和10.48倍(P<0.05)。PC-3悬浮成球细胞中CD44+CD133+细胞比率为13.94%,SP细胞含量为3.10%,均显著高于PC-3贴壁细胞的0.77%和0(P<0.05)。结论通过无血清悬浮聚球培养可以从PC-3细胞中简便、高效地富集前列腺癌干细胞。     

小鼠胚胎干细胞源性肝细胞的培养体系及分选

背景：已证实细胞可以向肝细胞分化。目前的研究集中在诱导分化上，对分化的肝细胞进行分选和进一步扩增研究较少。目的：比较不同的培养体系对胚胎干细胞源性的肝细胞生长的影响。设计：对比观察。材料：ES-D3细胞由上海细胞生物学研究所丛笑倩教授提供。方法：采用半固体培养D3小鼠胚胎干细胞系，形成胚胎体。将来源于18d的胚胎体用胰酶消化为单个细胞，在胶原处理过的培养皿中贴壁2h，分别采用Novastem培养体系、肝细胞培养液培养体系和普通培养体系培养3d。前2种培养体系又各分为含去除肝脏小鼠血清、含正常小鼠血清和无血清组3组，普通的培养体系分为含正常小鼠血清和含体积分数为O．1的胎牛血清2组。每组细胞均加入20ug／L肝细胞生长因子、20ug／L表皮生长因子。主要观察指标：细胞计数法分析细胞的增殖率，反转录-聚合酶链反应检测自蛋白的表达以及有限稀释聚合酶链反应法半定量检测胚胎源性肝细胞的含量。结果：①胚胎干细胞源性的肝细胞在不同的培养体系中，生长速度和肝细胞的含量不一样，在加有正常小鼠血清的Novastem培养基中，细胞增殖最快，在无血清的Novastem培养体系中，胚胎干细胞源性的肝细胞含量明显增高。②除了DMEM＋体积分数为0．1的胎牛血清组未检测到外，其他组均检测到了白蛋白表达。③在无血清Novastem培养体系中，肝样细胞含量明显增多。结论：无血清的Novastem培养体系能分选和扩增分化的肝细胞，提高肝细胞纯度。     

人胚胎干细胞分化为心肌细胞的体外实验

背景：体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞国内外已做了大量研究。然而，在国内对胚胎干细胞分化为心肌细胞的研究只限于小鼠胚胎干细胞，还未见有将人胚胎干细胞诱导为心肌细胞的报道。 目的：将人胚胎干细胞系H14诱导分化为心肌细胞。 设计：体外人胚胎干细胞培养细胞，采用悬浮法让其形成拟胚体，在不同的分化时期观察出现有节律性收缩的拟胚体的比率以及心肌特异性基因的表达。 单位：香港中文大学公共卫生学院何鸿粲防治传染病研究中心分子生物学实验室。 材料：实验所用人胚胎干细胞株H14来源于美国威斯康星大学WiCell研究所并授权使用。 方法：于2006—08／12在香港中文大学公共卫生学院何鸿粲防治传染病研究中心分子生物学实验室完成。采用悬浮法培养人胚胎干细胞株H14，让其形成拟胚体。4d后，将拟胚体培养在包被有明胶的6孔培养板内（5-10个胚胎体/孔），让其自发分化为跳动的拟胚体，显微镜下观察有节律性收缩的拟胚体；然后采用反转录聚合酶链反应方法检测心肌特异性基因的表达。 主要观察指标：不同的分化时期有节律性收缩的拟胚体的比率以及心肌特异性基因的表达。 结果：拟胚体形成8d后，大约有2％的拟胎体出现有节律性的收缩，随着时间的延长，产生收缩的拟胚体越多，到第16天，大约有10％的拟胚体出现节律性跳动，跳动频率为70～100次／min。反转录聚合酶链反应结果显示，有节律性收缩的拟胚体表达心肌特异性的转录因子GATA-4和Nkx25，心肌特异性基因IsI-1和α- MHC。 结论：国内首次成功使人胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞。     

13-甲基十四烷酸诱导前列腺癌DU145细胞凋亡的分子机制

目的 探讨侧链饱和脂肪酸13-甲基十四烷酸(13-MTD)诱导前列腺癌DU145细胞凋亡的分子机制.方法 体外培养人前列腺癌DU145细胞,分别用溶剂和140.μg/ml 13-MTD处理,在作用4、8和24h后.用Western blot检测Caspase酶底物多二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)、核纤层蛋白B受体(Lamin B)以及视母细胞瘤蛋白(Rb)是否断裂,观察Caspase酶抑制剂z-DEVD-fmk和z-VAD-fmk对Caspase酶抑制作用.监测13.MTD处理DU145细胞后是否使线粒体释放细胞色素c至胞浆,最后检测13-MTD对人前列腺正常上皮细胞、人乳腺正常上皮细胞、人皮肤正常角化细胞是否具有诱导凋亡作用.结果 经13-MTD处理的前列腺癌细胞,蛋白免疫印迹法检测到Caspase底物Lamin B、Rb以及PARP蛋白出现断裂,该反应可被Caspase抑制剂z-DEVD-fmk和z-VAD-fmk阻止,胞浆中可检测到从线粒体释放的细胞色素C.与前列腺癌细胞不同,经13-MTD处理过的正常前列腺上皮细胞、乳腺上皮细胞及皮肤角化细胞没有出现Caspase底物Lamin B断裂和细胞色素C释放.结论 13-MTD能选择性地诱导前列腺癌细胞凋亡而不作用于正常细胞,其凋亡是通过线粒体释放细胞色素C的Caspase依赖性途径.     

微小RNA-101对前列腺癌干细胞EZH2表达及增殖迁移的影响

目的 调控前列腺癌干细胞(PCSCs)中微小RNA-101(miR-101)表达,观察细胞中EZH2表达及其增殖迁移能力的变化.方法 通过流式分选从LNcap细胞株中获取PCSCs;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、Western blot、双荧光素酶、细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移实验观察miR-101对前列腺癌干细胞EZH2表达及增殖迁移能力影响.结果 在PCSCs中转染miR-101后,实验组较未处理组EZH2表达量下降46％ (P ＜0.05);双荧光素酶实验证实PCSCs中miR-101直接调控EZH2;凋亡实验中,实验组细胞凋亡率为(3.79±0.24)％,较对照组凋亡率明显增加(P＜0.05);周期实验中,实验组细胞G1期比例为(82.95±0.78)％,较对照组比例增加(P＜0.05),细胞被阻滞在G1/S期;迁移试验中,细胞迁移率为0.38±0.01,明显低于对照组(P＜0.05).结论 过表达miR-101能下调前列腺癌干细胞中EZH2的表达并能降低细胞的增殖迁移能力.     

人PC-3细胞系中前列腺癌干细胞的富集与鉴定

【目的】 从人前列腺癌PC-3细胞系中分离&#65380;富集并鉴定前列腺癌干细胞&#65377;【方法】 采用无血清培养液(SFM)悬浮细胞聚球法体外培养PC-3细胞系,通过传代更新&#65380;诱导分化&#65380;交替在含血清/无血清培养液中培养等方法鉴定PC-3悬浮成球细胞具有强增殖性&#65380;自我更新和分化潜能等肿瘤干细胞特性&#65377;以PC-3悬浮成球细胞为实验组,常规在含血清培养液(SSM)中单层贴壁培养的PC-3细胞为对照组,采用流式细胞术检测两种细胞中CD44+ CD133+细胞及侧群(SP)细胞比例&#65377;【结果】 PC-3成球细胞可以在SFM中生存并形成悬浮细胞球,悬浮培养第5天时开始可以观察到典型的悬浮细胞球形成,第10天时细胞球形成效率约为(2.6 ± 1.0)%,较第5天时明显增多(P < 0.05)&#65377;PC-3悬浮成球细胞具有自我更新和分化能力,在体外可以连续&#65380;稳定传代,在SFM中滴加血清后可以分化,交替培养于SSM和SFM中可以实现与贴壁细胞之间的相互转化&#65377;PC-3悬浮成球细胞中 CD44+ CD133+ 细胞比率为13.94%,SP细胞含量为3.1%,均显著高于常规培养的PC-3贴壁细胞(分别为0.77%和0.0%,P < 0.05)&#65377;【结论】 PC-3悬浮成球细胞具有肿瘤干细胞特性,采用无血清悬浮细胞聚球培养法可以从PC-3细胞系中简便&#65380;高效地富集前列腺癌干细胞&#65377;