抗人整合素β3亚基单克隆抗体的制备及其抗肿瘤活性的研究

目的制备抗人整合素β3亚基的单克隆抗体(mAb),研究其对肿瘤治疗的作用。方法用RT-PCR方法扩增人β3胞膜外基因,将其克隆至原核表达载体pQE30中,获得含β3胞膜外基因的高效表达载体pQE30-β3,将其转化大肠杆菌M15,通过诱导表达及纯化,获得β3蛋白。将此蛋白免疫BALB/c小鼠,应用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗β3亚基mAb,Western blot鉴定mAb的特异性。通过小鼠体内抑制黑色素瘤生长实验筛选出具有抑制肿瘤生长作用的mAb。进一步用MTT法及流式细胞术观察该mAb体外抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及诱导其凋亡的作用。结果扩增获得了β3胞膜外基因,构建了β3蛋白的原核表达载体,表达纯化了β3蛋白,成功制备了8株mAb,Western blot证明了其特异性。经过体内抑瘤实验筛选出一株具有显著抑制肿瘤生长的mAb4F12。该mAb可抑制HUVEC细胞增殖并诱导其凋亡。结论成功表达了β3蛋白,并制备了有活性的mAb,抗体具有抑制肿瘤生长的作用,这可能是通过抑制血管内皮细胞的增殖和诱发凋亡实现的。     

小细胞肺癌2F7单抗ScFv的高效表达及复性研究

目的 在大肠杆菌中高效表达小细胞肺癌单抗2F7的单链抗体（ScFv)，并获得具有生物学活性的ScFv。方法 利用PCR方法将2F7单抗重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一人工设计的柔性连接肽（Linker)连接，再将单链抗体基因重组到原核表达载体pQE31中，构建单链抗体高效表达载体pQE-2F7-ScFv。将pQE-2F7-ScFv质粒转化大肠杆菌M15后诱导表达，并对表达产物进行纯化和稀释复性。结果 获得了2F7单链抗体的高效表达，表达蛋白大小约27.4kD，以包涵体形式存在。包涵体蛋白在经过变性、纯化和稀释复性后，获得了有功能的单链抗体。结论 成功地构建和表达了小细胞肺癌单抗F27的单链抗体，并对其进行了纯化和复性，将进一步促进2F7单抗小分子抗体的应用。     

dl-扁桃酸热敏凝胶对家兔阴道黏膜刺激性的组织病理学研究

目的运用组织病理学方法评价dl-扁桃酸热敏凝胶(MA Gel)对家兔阴道黏膜的刺激性。方法 40只雌性日本大耳兔随机分为基质对照组、MA Gel低剂量组(10 mg/ml)、中剂量组(20 mg/ml)、高剂量组(40 mg/ml)和市售壬苯醇醚凝胶(40 mg/ml, N-9 Gel)组。阴道给予凝胶2.5 ml,1次/d,连续给药10 d。末次给药72 h后处死家兔,取阴道组织,观察阴道黏膜组织病理学改变;运用原位缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling, TUNEL)检测阴道黏膜上皮细胞凋亡;运用免疫组织化学法检测阴道黏膜内增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的阳性表达。结果家兔阴道黏膜组织苏木素-伊红(HE)染色显示,MA Gel的黏膜刺激性呈剂量依赖性,高剂量组可造成黏膜上皮轻度损伤、固有层毛细血管充血和炎症细胞浸润(病理学评分4.35±1.04),与N-9 Gel组7.88±1.67相比,差异有统计学意义(P0.05)。TUNEL检测结果显示,MA Gel 3个剂量组均出现不同数量的凋亡细胞阳性表达,分布于上皮层和黏膜固有层。与基质对照组相比,MA Gel各组的阴道黏膜细胞凋亡细胞数目差异无统计学意义(P0.05)。MA Gel 3个剂量组黏膜上皮固有层均出现PCNA阳性表达,且表达量与扁桃酸浓度呈正相关,提示MA Gel可诱发炎症细胞轻度的活化增殖,但较N-9 Gel组为轻。结论 MA Gel对家兔阴道黏膜有轻度的刺激性,但刺激性远低于市售N-9 Gel。MA Gel安全性较好,作为阴道外用避孕新药具有潜在开发前景。     

五行汤抗肿瘤及经钙离子介导的促肿瘤细胞凋亡作用

目的:明确五行汤的抗肿瘤作用并初步探讨其机制.方法:不同浓度五行汤处理培养肿瘤细胞, MTT检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;琼脂糖凝胶电泳检测细胞DNA变化;电镜观察细胞形态变化;特异性荧光探针检测胞浆钙离子浓度变化.结果:五行汤对多种肿瘤细胞生长有较特异的抑制作用;五行汤处理后的SGC-7901细胞经流式细胞仪检测出现亚二倍体峰,并呈时间-浓度依赖性;琼脂糖凝胶电泳呈现的DNA Ladder;电镜显示五行汤处理后的SGC-7901细胞呈现凋亡特征;Fluo-3 AM染色荧光显微镜观察到胞浆钙离子浓度升高;胞内钙离子拮抗剂Bapta AM可以明显降低五行汤处理后SGC-7901细胞的凋亡率,且对细胞的保护作用呈浓度依赖性.结论:五行汤有较明确的抑制肿瘤细胞生长作用,可能通过钙离子介导的肿瘤细胞凋亡发挥作用.     

肝癌抑制基因-1与转运功能相关的451 bp序列区的确定

背景与目的:肝癌抑制基因-1(HCCS1)是一种潜在的肝癌抑制基因,并且在细胞内蛋白分拣运输中也发挥着重要作用,其抑癌作用有可能是通过其蛋白转运的功能而发挥的,本文以寻找HCCS1序列中与转运相关的最小功能序列区域为目的.方法:通过亚克隆技术,构建以pEGFP-C2为载体的含不同长度HCCS1cDNA片段的亚克隆,将构建的亚克隆转染子宫颈癌HeLa细胞,通过免疫荧光共聚焦显微镜观察不同长度HCCS1蛋白的分布,以及与6-磷酸甘露糖受体(M6PR)的共定位.结果:成功构建了以pEGFP-C2为载体的10个含有不同长度HCCS1片段的亚克隆;HCCS1cDNA从3'端向5'端逐渐缺失的片段中:2 100 bp片段至778 bp片段编码的不同长度HCCS1蛋白呈颗粒状分布于核周的胞质内,其中2 100 bp片段至1 571 bp片段编码的不同长度HCCS1蛋白均呈颗粒状、极性分布于核周的胞质内,且与M6PR有共定位;而1 120 bp片段至778 bp片段编码的不同长度HCCS1蛋白虽然也呈颗粒状分布于核周,但极性分布消失,且与M6PR共定位消失;HCCS1cDNA片段678 bp片段至339 bp片段编码的不同长度HCCS1蛋白呈散点状弥散分布于胞质以及胞核内.结论:确定了HCCS1cDNA 1 571 bp片段的3'端451 bp的序列为与HCCS1转运功能相关的最小区域范围.     

Nest-PCR和PCR-RFLP在恶性疟原虫地理株基因分型及多态性研究中的应用

目的 分析套式PCR（nest-PCR）和限制性内切酶片段长度多态性（PCR-RFLP）方法在恶性疟原虫地理株裂殖子表面蛋白（MSP2）基因多态性研究中的分型效率及特异性。 方法 分别在海南省三亚市和云南省腾冲县等地通过静脉采血法采集疟疾患者血样98份,其中恶性疟88份,间日疟10份。另从上海地区的健康人群中抽取10份血样作为阴性对照。用nest-PCR和PCR-RFLP方法分别对疟原虫地理株进行MSP2等位基因分型,并对分型结果进行归纳和比较分析。 结果 常规nest-PCR方法对于恶性疟原虫地理株MSP2等位基因的总检出效率为79.8％（166/208）,其中,对于FC27家族等位基因的检出效率为92.7％（101/109）,但对3D7家族等位基因的检出率仅为65.7％（65/99）,且无法鉴定具体的等位基因。PCR-RFLP分型法检出效率比nest-PCR法提高了20.2%,且特异性好。 结论 PCR-RFLP相对于常规的nest-PCR分型法具有检出效率、分辨率和特异性皆高的优点,可以鉴定地理株中具体的等位基因类型。     

恶性疟原虫氯喹抗性机制研究进展

目的目前疟原虫抗药性已成为全球性严重的公共卫生问题,现有的抗疟药物大部分已产生程度不同的抗药性。研究药物抗性产生的分子机制对研制新型抗疟药、降低抗性产生速率以及对抗性实施监测都具有重要意义。氯喹作为最早发现和使用的最为有效抗疟药物,在大规模用于疟疾治疗后,恶性疟原虫陆续产生对氯喹的抗药性,并且抗性虫株在全球范围迅速播散。近二十年来对氯喹作用机制和抗药性产生的分子机制的研究已取得很大进展。本文将讨论近年来有关氯喹抗性产生相关的分子机制,尤其是与抗药性密切相关的两个基因,即恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因（Pfcrt）与恶性疟原虫多药物抗性基因-1（Pfmdr1）的研究进展。     

眼袋整形术的术式选择

自1998年6月以来,我们打破传统单一的眼袋整形术的手术方法,根据临床表现和解剖学特点将眼袋分为四型,并根据分型不同采取不同的手术方式,减少了眼袋手术并发症的发生,并获得满意的手术效果。     

肝癌抑制基因-1肿瘤靶向性表及其特异性抗肿瘤作用

目的 建立肝癌抑制基因-1(HCCS1)肿瘤靶向性表达载体,提高肿瘤治疗的安全性.方法 活细胞计数试剂盒测定HCCS1高表达对正常细胞和肿瘤细胞的影响,荧光素酶试验检测肿瘤特异性启动子PEG-3p在正常肝细胞和肝癌细胞中的相对转录活性,AdEasyTM系统包装并利用PCR鉴定重组腺病毒Ad-PEG-3p-HCCS1,Western blot检测重组腺病毒感染后HCCS1在正常细胞和肿瘤细胞中的表达情况,结晶紫试验和四甲基偶氮唑盐试验观察该重组腺病毒体外抗肿瘤的靶向性. 结果 HCCS1高表达对肿瘤细胞株BEL-7404和SW-620的生长抑制作用明显超过正常细胞株L02和正常人肺成纤维细胞,96 h抑制率达60%.荧光素酶试验显示,PEG-3p在BEL-7404、BEL-7405、QGY-7703中的相对转录活性分别为L02的3.9、4.7、1.5倍.成功构建了新抑癌基因HCCS1肿瘤靶向性表达的重组腺病毒Ad-PEG-3p-HCCS1,Western blot检测结果显示,在BEL7404和QGY-7703中,HCCS1表达高于在L02中的表达.结晶紫试验和四甲基偶氮唑盐试验显示,Ad-PEG-3p-HCCS1与Ad-CMV-HCCS1相比,在不降低对肿瘤抑制效果的前提下,明显降低了对正常细胞的杀伤作用. 结论 肿瘤细胞对HCCS1的生长抑制作用更为敏感,PEG-3p在肝癌细胞中也具有肿瘤特异性,Ad-PEG-3p-HCCS1可特异性地在肿瘤细胞中表达HCCS1,从而提高HCCS1基因治疗的安全性.     

小细胞肺癌抗独特型疫苗功能的试验研究

目的探讨小细胞肺癌(SLCL)抗独特型抗体3F6和其单链抗体(3F6SeFv)诱导体液和细胞免疫应答的能力,以证明其作为抗SCLC疫苗的可行性。方法3F6和3F6SeFv(Ab2)免疫BALB/c小鼠获得抗血清,以ELISA和Western blot方法分别检测抗血清中Ab3结合SCLC细胞膜表面特异抗原(NCI-H128抗原)的能力,用竞争Western blot检测Ab3与2F7竞争结合NCI-H128抗原的能力。以迟发型超敏反应(DTH反应)和小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验检测3F6及3F6SeFv诱发细胞免疫应答的潜能。结果ELISA和Western blot方法均证明,3F6和3F6SeFv免疫同系小鼠所产生的Ab3能特异的与NCI-H128抗原相结合,与对照血清相比,差异有统计学意义(P<0.001),且有很强的与2F7(Ab1)竞争结合靶抗原的能力。在DTH反应中,3F6和3F6SeFv所致小鼠足垫肿胀的程度均明显高于对照组(P<0.001)。小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应试验证明,用3F6和3F6SeFv免疫的小鼠脾脏淋巴细胞对靶细胞的再次刺激有明显的增殖反应,与阴性肿瘤细胞对照组和阴性抗体对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论抗独特型抗体3F6和3F6ScFv均有模拟SCLC细胞膜表面特异抗原的能力,成功诱导了相应的体液和细胞免疫应答,可作为抗SCLC疫苗进行深入研究。