Smad3基因小干扰RNA的序列设计及其表达载体的构建

目的构建大鼠Smad3基因小干扰RNA的表达质粒,为肝纤维化RNAi介导的基因治疗打下基础。方法利用互联网资源针对Smad3基因设计并合成三条可能的小干扰RNA,脂质体瞬时转染大鼠肝星状细胞,RT-PCR检测Smad3基因的表达情况。然后将这三条小干扰RNA插入到RNA干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中,构建成三条干扰载体并测序。结果 RT-PCR和测序结果表明,成功构建了Smad3基因的RNA干扰真核表达载体。结论重组质粒pRNAT-SiSmad3的成功构建,为后续的Smad3基因下调实验提供了可能。     

siRNA下调Smad3基因后对多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶表达的影响

目的以Smad3基因为研究对象,筛选出该基因的有效siRNA干扰载体,并探讨下调表达Smad3基因对多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶（ppGalNAcTs）家族mRNA水平表达的影响。方法将事先构建的3个带有荧光标记的干扰载体分别转染人肝星状细胞株（HSC）中,通过RT-PCR、Western blot方法分别从mRNA水平及蛋白水平检测干扰效率。并通过转染有效的Smad3基因的siRNA表达载体,检测下调Smad3以后对糖基转移酶ppGalNAcTs家族mRNA表达的影响情况。结果成功筛选到Smad3基因的有效siRNA干扰载体,检测出转染了Smad3的siRNA表达载体的肝星状细胞中Smad3的mRNA和蛋白表达都受到了抑制,而糖基转移酶ppGalNAcTs的mRNA表达也随之发生了一些变化。结论成功筛选到一个Smad3基因的siRNA干扰载体,继而可转染人肝星状细胞,并抑制其中Smad3蛋白的表达,为研究siRNA方法在肝纤维化中的治疗作用提供了实验基础和理论支持。     

糖基转移酶基因β3GalT7／GnT8和β3GnT2在白血病细胞株及人骨髓有核细胞中的表达

目的: 从mRNA水平观察不同白血病细胞和人骨髓标本中糖基转移酶β3GalT7/GnT8和β3GnT2的表达情况. 方法: 采用RT-PCR技术,在8种白血病细胞株及24例白血病患者骨髓有核细胞中检测β3GalT7/GnT8,β3GnT2 mRNA水平的表达,以10例正常成人骨髓有核细胞作相对正常对照.结果: β3GalT7/GnT8在SHI-1,THP-1,HL-60,K562,NB4,U937细胞和18例初诊白血病患者骨髓标本中有不同程度的表达,在KG1,Raji细胞和相对正常对照中没有表达;β3GnT2在SHI-1,THP-1,HL-60,K562,NB4,U937,Raji细胞,4例相对正常对照和16例初诊白血病患者骨髓标本中有不同程度的表达,在KG1细胞中和6例相对正常对照中没有表达. 结论: β3GalT7/GnT8和β3GnT2与白血病的发生发展存在一定的关系,其mRNA的表达水平可以作为白血病早期诊断的一个标志.     

ppGalNAc-T2基因下调对肝星状细胞TGFβ1-Smad3激活途径基因表达的影响

目的 探讨糖基转移酶ppGalNAc-T2对大鼠肝星状细胞的转化生长因子(TGF)β1-Smad3激活的影响.方法 在大鼠肝星状细胞中转染ppGalNac-T2的siRNA表达质粒,用RT-PCR检测相关基因mRNA表达,Western blot以及免疫荧光方法检测Smad3基因蛋白表达.结果 相对于正常细胞,ppGalNAc-T2下调后,肝星状细胞中Smad2、Smad3、Smad4、胶原3αl(Col3α1)、转化生长因子β调节基因4(Tbrg4)、TGFβ、TGFβ2及转化生长因子β受体(TGFβr)3的mRNA及Smad3的蛋白表达几乎没有变化(P>0.05),但TGFβrl和TGFβ2都有较大程度的降低(P<0.05).结论 在大鼠肝星状细胞中,ppGalNAc-T2下调对于TGFβ1-Smad3激活途径基因表达基本没有影响,其在肝星状细胞中的具体功能有待于进一步研究.