Time course of cell death induced by traumatic brain injury on mice

研究背景：尽管脑外伤（traumatic brain injury, TBI）后神经细胞死亡的各种分子机制研究取得了很大进展,但由于细胞死亡标记方法的限制,使得TBI后细胞死亡发生的时程变化规律以及TBI引起神经细胞死亡的确切机制（占主导的是机械外力直接破坏还是继发的程序性控制）仍然不明。 目的：发现能够在TBI早期至晚期全程标记在体细胞死亡的标记物及使用方法,阐明TBI引发的神经细胞死亡规律并探讨TBI引起的神经细胞死亡机制,为临床救治TBI病人提供最佳时间窗口。 实验设计,时间及实施：在活体TBI动物模型上使用碘化丙啶(propidium iodide, PI)作为神经细胞死亡标记物,采用随机分组的方法进行实验,即将体重均衡的65只健康昆明小鼠随机分成假手术组,TBI后0 min、10 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 day、14天和21天组。整个实验于2007年9月至2008年12月在苏州大学衰老与神经疾病重点实验室完成。 材料：昆明小鼠（由苏州大学实验动物中心提供）;PI (B1221)购买于Sigma公司;定量脑皮质自由落体打击（controlled cortical impact, CCI）装置;体视学显微镜及软件（Nikon公司）。 实验方法：通过预实验证明,动物处死前1 h腹腔注射进行PI标记的方法最为简便,并且能够显示细胞死亡的形态学变化。因此,按照实验分组使用CCI装置建立定量TBI动物模型,动物处死前1 h腹腔注射PI（1μg/g）,取脑后连续冰冻切片,采用体视学显微镜及软件对每张切片中的伤侧全部脑片随机5个视野进行PI阳性细胞计数。实验结果采用ANOVA并进行t检验。 结果：PI 阳性细胞计数结果显示,与假手术组和TBI后0 min 组比较,其他各个实验组均可见数量不等的PI阳性细胞。TBI后10 min和30 min时间点仅发现有少量PI阳性细胞,之后开始大量增加,尤其是在TBI后1 h到6 h这段时间PI阳性细胞数量上升最快,而在TBI后24 h和48 h时间点PI阳性细胞数量达到高峰,之后逐渐减少,在TBI后21天仍可见有PI阳性细胞。 结论：PI可以作为在体细胞死亡标记物;TBI所引起的神经细胞死亡除了机械性外力直接作用外,主要是继发的程序性死亡（包括凋亡、自噬性细胞死亡,甚至程序性坏死）;TBI后48 h内是临床保护神经元、救治TBI病人的关键时期。     

泊洛沙姆188对体外神经元损伤后线粒体损害的作用研究

目的探讨泊洛沙姆188(Poloxamer 188,P188)对体外神经元损伤引起的细胞死亡及线粒体损害可能发挥的作用机制。方法采用小鼠的原代神经元培养并建立体外神经元离心损伤模型(VCID),在损伤后10 min加入P188,观察神经元的形态变化,MTT法与LDH法检测P188对体外神经元损伤引起细胞死亡的影响。分离线粒体亚成分,采用免疫印记法检测损伤后6 h与24 h线粒体内与胞质中CytC的表达情况,并检测P188对体外神经元损伤后caspase-3表达的影响。结果显微镜观察到:与正常组相比,损伤组在外伤后24 h出现了一些结构与形态上的改变。P188处理过的神经元在损伤后24 h,在形态特征上发生明显的恢复,与对照组的形态特征类似。MTT法与乳酸脱氢酶(LDH)法结果显示:P188能明显减轻损伤引起的神经元死亡与乳酸脱氢酶漏出率。Western blot结果显示:在损伤后6 h与24 h,P188处理后均能明显抑制损伤后线粒体成分中CytC蛋白水平的下调(P<0.05),及胞质成分中CytC蛋白水平的上调(P<0.05),提示P188能明显抑制外伤引起CytC蛋白的释放。同时,P188也能抑制外伤引起的激活型caspase-3(p20)的上调(P<0.05)。结论 P188对体外神经元损伤引起的细胞死亡及线粒体损害具有明显的神经保护作用,这种保护作用可能与抑制线粒体膜完整性破坏和抑制凋亡的线粒体途径有关。     

E64d对创伤性脑损伤小鼠神经细胞的保护作用

目的探讨组织蛋白酶B和μ-钙激活蛋白酶的特异性抑制剂E64d对创伤性脑损伤（TBI）后神经细胞的保护作用,并对其调节机制进行初步探讨,为临床救治TBI患者提供新的靶点。方法采用改良的自由落体损伤装置建立小鼠TBI模型,实验组侧脑室注射0.5μg/μl的E64d 1μl,对照组侧脑室注射等体积1%的二甲基亚砜,并按伤后时间不同分为伤后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h组,并按时间点断头取脑,运用Western blot法检测TBI后各实验组脑组织中凋亡相关蛋白caspase-3、tBid的表达情况,运用免疫荧光法进行caspase-3阳性细胞计数。结果实验组凋亡相关蛋白caspase-3、tBid的表达量明显降低,且以伤后24～48 h最为显著（P〈0.05）。结论 E64d可以通过阻断内外源的凋亡通路对TBI后神经细胞起保护作用,改善神经细胞损伤导致的神经功能障碍,可能为治疗脑外伤提供新靶点,为研究防治创伤性脑损伤后继发性损伤提供新思路。