调节性核糖核酸酶 1对高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤的保护作用

目的探讨调节性核糖核酸酶 1(Reg1)对高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤的保护作用及机制。方法 2018年 8月至 2020年 2月构建高糖诱导的 RGC-5视网膜神经节细胞损伤模型,实验分为四组: Con组(正常糖 +未转染的 RGC-5细胞)HG组(高糖 +未转染的 RGC-5细胞)、 pcDNA3-Reg1组(高糖 +转染 Reg1过表达质粒的 RGC-5细胞)、 pcDNA3-NC组(高糖 +转染对、照质粒的 RGC-5细胞)。实时荧光定量聚合酶链式反应检测 Reg1、白细胞介素( IL)-1β、IL-6、IL-12、肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)的表达;蛋白质免疫印迹检测 Reg1、B淋巴细胞瘤 -2(Bcl-2)、 Bcl-2相关 X蛋白( Bax)、活化的胱天蛋白酶 3(cleaved caspase-3)、磷酸化 p65(p-p65)、磷酸化核因子 κB抑制蛋白 α(p-IκBα)的表达;免疫荧光染色检测 Reg1、p-p65的表达; TUNEL染色检测凋亡水平;酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中各炎性因子的含量。结果 Con组中 Reg1的相对荧光强度、 mRNA相对表达量、蛋白质相对表达量分别为 1.00±0.21、1.00±0.15、1.00±0.18,HG组 Reg1的相对荧光强度、 mRNA相对表达量、蛋白质相对表达量分别为 2.49±0.36、3.86±0.42、3.17±0.39,pcDNA3-Reg1组 Reg1的相对荧光强度、 mRNA相对表达量、蛋白质相对表达量分别为6.77±0.72、8.18±0.67、6.30±0.51,pcDNA3-NC组 Reg1的相对荧光强度、 mRNA相对表达量、蛋白质相对表达量分别为 2.75±0.40、3.59±0.38、2.85±0.34,HG组、 pcDNA3-NC组 Reg1相对荧光强度、 mRNA和蛋白质相对表达量高于 Con组,且低于 pcDNA3Reg1组( P<0.05)。 Con组 TUNEL+细胞比例、 Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3分别为( 1.73±0.22)%、1.00±0.28、1.00±0.20、1.00±0.17,HG组 TUNEL+细胞比例、 Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3分别为( 14.79±0.83)%、0.29±0.11、5.25±0.66、4.93±0.52,pcDNA3Reg1组 TUNEL+细胞比例、 Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3分别为( 3.77±0.34)%、0.58±0.43、2.51±0.45、2.58±0.33,pcDNA3-NC组 TUNEL+细胞比例、 Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3分别为( 14.55±0.90)%、0.21±0.14、5.14±0.59、4.77±0.46,Con组、 pcDNA3-Reg1组 TUNEL+细胞比例、 Bax、cleaved caspase-3蛋白质相对表达量低于 HG组、 pcDNA3-NC组,而 Bcl-2蛋白质相对表达量高于 HG组、 pcDNA3-NC组( P<0.05)。 Con组、 pcDNA3-Reg1组细胞 IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α mRNA相对表达量,及上清液蛋白质含量低于 HG组、 pcDNA3-NC组( P<0.05)。 Con组、 pcDNA3-Reg1组 p-p65相对荧光强度,及 p-p65、p-IκBα蛋白质相对表达量低于 HG组、 pcDNA3-NC组( P<0.05)。结论高糖状态下 RGC-5视网膜神经节细胞高表达 Reg1,上调 Reg1表达可以降低细胞凋亡及炎症,可能与抑制 NFκB信号通路活化有关。     

一氧化氮合酶与眼部血管疾病研究进展

一氧化氮是近年来的一个研究热点,它是信号转导系统的重要分子,一氧化氮也在炎症、血管病变、肿瘤形成及创伤等很多领域起关键作用,但是由于一氧化氮化学性质极其不稳定,因此催化其合成的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)便成了研究的主要对象.目前,NOS与新生血管的研究很多,但具体作用机制还不是很清楚,本文就NOS与眼部血管病变机制的研究进展进行综述.     

原花青素调控miR-21表达对糖尿病视网膜病变大鼠血管内皮细胞功能及视网膜神经节细胞的保护机制研究

目的 观察原花青素对miR-21的影响,探讨原花青素对糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）大鼠血管内皮细胞功能及视网膜神经节细胞的保护机制。 方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),采用不同浓度（5、25、50、75、100 mg/L）原花青素处理细胞24 h后,用CCK-8法检测细胞增殖活性并筛选出原花青素50 mg/L进行后续实验,采用细胞划痕实验法测定细胞迁移能力,采用定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）检测miR-21的表达;将30只大鼠分为正常组、模型对照组和原青花素250 mg/kg组,正常组不经处理,模型对照组和原青花素250 mg/kg组经过腹腔注射链脲佐菌素诱导大鼠DR,原青花素250 mg/kg组经过灌胃250 mg/kg原花青素干预2周,采用显微镜观察视网膜细胞情况,TUNEL法测定神经节细胞凋亡情况,定量PCR检测miR-21的表达。 结果 原花青素抑制HUVECs增殖的效果呈浓度依赖性,5 mg/L组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）,25 mg/L、50 mg/L、75 mg/L和100 mg/L组与对照组比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。50 mg/L迁移能力较对照组减弱,miR-21表达下调（P＜0.05）;模型对照组和原花青素250 mg/kg组大鼠视网膜miR21表达量高于正常组,模型对照组高于原花青素250 mg/kg组（P＜0.05）。模型对照组和原花青素250 mg/kg组大鼠视网膜神经节细胞凋亡指数大于正常组,模型对照组大于原花青素250 mg/kg组。 结论 原花青素能够抑制血管内皮细胞增殖、迁移,并抑制DR大鼠视网膜神经节细胞凋亡,保护视网膜病变,其机制可能与下调miR-21表达有关。     

小鼠视网膜铺片免疫荧光染色技术的探讨

目的 探讨一种简便、易操作的小鼠视网膜铺片免疫荧光染色技术.方法 30只C57BL/6J成年小鼠行40 g·L-1多聚甲醛心脏灌注固定,摘取眼球,剥离视网膜,随机分为3组:A组20个视网膜直接置于3 g·L-1 Triton X-100中4℃孵育1 h;B组20个视网膜先置入甲醇冰上固定30 min,再置于3 g·L-1 Triton X-100中4℃孵育1 h;C组20个视网膜先置入甲醇冰上固定30 min,再置于3 g·L-1 Triton X-100中4℃孵育过夜.各组分别行α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色,荧光显微镜下照相,观察其差异.结果 荧光显微镜下观察,A组视网膜血管荧光微弱,血管模糊不清;B组视网膜可见荧光,血管分枝清晰可见,但荧光较弱;C组视网膜荧光强亮,α-平滑肌肌动蛋白特异性表达在血管内皮细胞及周细胞的胞膜上,荧光呈空泡状,背景染色轻.结论 视网膜铺片免疫荧光染色是一种较好的、简便易行的视网膜组织形态学观察方法,实验过程中甲醇脱脂处理和足够的Triton X-100浸泡是保证染色成功的关键.