人源化抗人肺癌单域抗体基因的构建、表达及活性分析

目的： 构建人源化的抗人肺癌单域抗体hu3D3VH基因, 在大肠杆菌中表达, 对其蛋白活性进行分析.方法： 采用CDR移植技术对mAb3D3的重链可变区进行人源化, 通过重叠PCR获得hu3D3VH的基因.构建pET22（b＋）/hu3D3VH表达载体, 并转化大肠杆菌BL21（DE3）, 在IPTG诱导下表达.表达产物通过Ni亲和层析柱纯化.采用间接ELISA和竞争抑制ELISA法进行活性分析.结果： 通过重叠PCR获得序列正确的目的基因.目的蛋白以包涵体的形式表达, 表达量占菌体总蛋白的30%以上.纯化后, 目的蛋白的纯度达95%以上.hu3D3VH具有与亲本抗体相同的抗原反应性, 并能抑制mAb3D3与L342细胞的结合.结论： 获得的人源化单域抗体hu3D3VH, 保留了与mAb3D3相同的反应性和特异性, 为进一步临床应用奠定了基础.     

人源化抗人肺癌二价和四价VH单域抗体的制备及活性分析

目的为提高人源化的抗人肺癌单域抗体hu3D3vH的功能性亲和力,制备其二价和四价的抗体分子。方法重组PCR分别将SV5-Cys短肽和p53四聚化结构域基因与hu3D3VH基因融合,而获得同源二聚体dihu3D3VH和同源四聚体tehu3D3VH基因。将两种基因克隆至pET-22b( )表达载体,并分别在E.coli BL21(DE3)中表达。表达产物通过N2 亲和层析柱纯化。用FITC分别标记hu3D3vH、dihu3D3VH和tehu3D3V三种抗体分子,通过免疫荧光实验分析其抗原反应性和特异性,并利用流式细胞术比较分析其功能性亲和力。结果两种基因均以单体形式并主要以包涵体的形式表达,纯化并复性后,其蛋白溶液中分别存在约50%的二聚体和70%的四聚体。dihu3D3VH和te- hu3D3VH均保留了hu3D3VH的抗原反应性和特异性;且与hu3D3VH相比,其功能性亲和力分别提高了约60%和160%。结论采用增加结合价的策略,有效地改善了hu3D3VH的功能性亲和力。     

用于肿瘤血管靶向治疗的RGD/tTF融合蛋白的表达及活性鉴定

目的：制备用于肿瘤血管靶向治疗的重组RGD／tTF融合蛋白，并鉴定其生物学活性。方法：利用PCR技术均建RGD与tTF的融合基因，克隆至表达载体pET22b（＋），在E．coliBL21（DE3）中表达，镍亲和层析柱纯化。凝血实验和FX活化实验鉴定融合蛋白中tTF的活性，间接ELISA分析RGD活性。结果：获得序列正确的RGD／tTF／pET22b（＋）重组子，融合蛋白在E．coliBL21（DE3）中高效表达。纯化后的融合蛋白具有活化FX、引起血液凝固的功能，且能与α，β3特异性结合。结论：成功构建RGD／tTF／pET22b（＋）重组子，RGD／tTF融合蛋白具有TF活性且与d，B，特异性结合，为进一步研究其体内特异性诱发肿瘤组织血管栓塞功能创造了条件。     

肺癌靶向通用载体hu3D3/cSA融合蛋白的制备和活性分析

目的 制备一种新型的肺癌靶向通用载体hu3D3与核心链霉亲和素(core-streptavidin,cSA)的融合蛋白hu3D3/cSA,并鉴定其活性.方法 PCR扩增cSA基因,克隆至质粒hu3D3/pET-22b(+)而获得表达载体hu3D3/cSA/pET-22b(+),并在E. coli BL21(DE3)中表达,镍亲和层析柱纯化hu3D3/cSA融合蛋白,采用TEA缓冲液进行复性.SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白四聚体的形成.FITC标记hu3D3/cSA,通过荧光显微镜分析hu3D3组分的抗原反应性和特异性,流式细胞术比较hu3D3/cSA和hu3D3与靶点的结合能力;ELISA和Western blot鉴定cSA组分结合生物素(biotin)的能力.结果 获得序列正确的hu3D3/cSA/pET-22b(+)重组子,融合基因在E.coli BL21(DE3)中主要以包涵体的形式表达.纯化复性后的融合蛋白能够形成四聚体复合物,保留了cSA结合生物素的活性,hu3D3组分能与肺癌细胞表面抗原结合,且结合能力与单体hu3D3相比有明显增强.结论 成功制备了具有结合靶抗原和生物素活性的hu3D3/cSA融合蛋白,同时改善了hu3D3组分结合其靶点的亲合力(avidity).因此,hu3D3/cSA可以作为一个通用的肺癌靶向载体,与多种生物素化的抗肿瘤药物或试剂联用,有望为多药物联合靶向治疗肺癌提供一种可行的方法.     

肺癌靶向血栓蛋白hu3D3V_H-tTF的表达及活性鉴定

目的制备一种用于肺癌血管靶向栓塞治疗的融合蛋白hu3D3VH-tTF,并鉴定其生物学活性。方法利用重叠PCR技术构建tTF与hu3D3VH的融合基因,克隆至表达载体pET22 b(+),在E.coliBL21(DE3)中表达,镍亲和色谱柱纯化目的蛋白。ELISA检测融合蛋白hu3D3VH组分与肺腺癌细胞A549选择性结合活性,凝血实验和FⅩ活化实验鉴定融合蛋白tTF组分的促凝血活性。结果获得序列正确的hu3D3VH/tTF/pET22 b(+)重组子,融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达。纯化后的融合蛋白与肺腺癌细胞A549具有选择性结合活性,并能活化FⅩ、有效促发血液凝固。结论成功构建hu3D3VH/tTF/pET22 b(+)重组子,hu3D3VH/tTF融合蛋白具有hu3D3VH的选择性结合能力同时具有TF的促凝血活性,为开展选择性肺肿瘤血管血栓性栓塞研究奠定了基础。     

诱骗受体DcR3的基因构建、表达及特异性鉴定

目的:构建适于原核表达的人诱骗受体DcR3基因,并进行重组蛋白的表达纯化及特异性鉴定。方法:查得人DcR3cDNA全序列,将其分段设计引物,通过重叠PCR获得DcR3基因。构建pET-22b( )/DcR3表达载体,转化大肠杆菌Rosseta-gami,IPTG诱导表达,Ni柱纯化。采用ELISA进行特异性鉴定。结果:通过重叠PCR获得了编码正确氨基酸序列的目的基因。目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,蛋白纯度达95%以上。ELISA结果表明所纯化的蛋白可与抗DcR3抗体发生特异结合。结论:诱骗受体DcR3基因的成功构建、表达及纯化,为进一步的功能研究奠定了基础。     

肺癌靶向血栓蛋白hu3D3VH-tTF的表达及活性鉴定

目的制备一种用于肺癌血管靶向栓塞治疗的融合蛋白hu3D3VH-tTF，并鉴定其生物学活性。方法利用重叠PCR技术构建tTF与hu3D3VH的融合基因，克隆至表达载体pET22b（＋），在E．coli B121（DE3）中表达，镍亲和色谱柱纯化目的蛋白。ELISA检测融合蛋白hu3D3VH组分与肺腺癌细胞A549选择性结合活性，凝血实验和FX活化实验鉴定融合蛋白tTF组分的促凝血活性。结果获得序列正确的hu3D3VH／tTF／pET22b（＋）重组子，融合蛋白在E．coli B121（DE，）中高效表达。纯化后的融合蛋白与肺腺癌细胞A549具有选择性结合活性，并能活化FX、有效促发血液凝固。结论成功构建hu3D3VH／tTF／pET22b（＋）重组子，hu3D3VH／tTF融合蛋白具有hu3D3VH的选择性结合能力同时具有TF的促凝血活性，为开展选择性肺肿瘤血管血栓性栓塞研究奠定了基础。