植物乳杆菌联合大豆多肽对小鼠肠道菌群的影响

目的 为探究植物乳杆菌HZLP-005(Lactobacillus plantarum HZLP-005)联合碱性蛋白酶制备的大豆多肽(soybean peptide prepared by alkaline protease,SPAP)对小鼠肠道菌群的调节作用.方法 随机将60只6 w雄性BALB/C小鼠分为4组:分...     

禽巴氏杆菌OmpH外膜蛋白DNA疫苗的免疫效果

目的:研究禽多杀性巴氏杆菌omph DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫保护效果。方法:利用PCR技术扩增出禽多杀性巴氏杆菌的omph基因片段,克隆到pMD18-T上,再亚克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pOMPH,体外转染SP2/0细胞,RT-PCR、间接免疫荧光试验、Western blot检测其转录及表达情况。然后进行动物免疫,实验动物分为三组即:pOMPH组、pCDNA3.1(+)空载体组和PBS对照组,每组16只BALB/c小鼠,pOMPH组和pCDNA3.1(+)组以100μg/只的剂量肌注免疫,PBS组每只小鼠肌注100μl1×PBS,各组均进行了三次免疫,每次间隔两周。间接ELISA检测免疫后小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况,三免两周后检测脾淋巴细胞IFN-γ分泌情况。强毒攻击,计算小鼠存活数目及保护率。结果:间接免疫荧光试验、Western blot和RT-PCR检测结果均表明pOMPH可在体外培养的SP2/0细胞中表达目的蛋白。动物免疫后,pOMPH组免疫小鼠血清抗体水平持续上升,与pCDNA3.1(+)组和PBS组相比差异极显著(P0.01)。经提取的外膜蛋白(Omps)刺激后,pOMPH组的刺激值(SI值)与pCDNA3.1(+)组及PBS免疫组相比均差异显著(P0.05)。免疫小鼠脾细胞产生的IFN-γ极显著高于两对照组产生的IFN-γ(P0.01)。攻毒后pOMPH组保护率明显高于两对照组,可达70%。结论:成功构建了禽多杀性巴氏杆菌omph DNA疫苗,该疫苗可诱导免疫小鼠产生较强的体液和细胞免疫应答及较好的保护效果。     

康肽宝对抗生素标准品的抑菌效果影响研究

为了研究康肽宝对抗生素抑菌效果的影响,本实验选取12种常用的抗生素标准品,分别测定它们对所选取的13种病原菌的抗菌谱和最小抑菌浓度(MIC),初步探讨康肽宝与各种抗生素混合后的抑菌活性,并采用分级抑制浓度指数(FIC)来定量检测康肽宝对抗生素的影响效果.结果发现,康肽宝和抗生素对不同细菌的抗菌活性不同,康肽宝与不同抗生素之间的抗菌作用关系因细菌种类而不同.康肽宝对13种测试病原菌均有抑菌效果,对产肠毒大肠埃希菌、鸡大肠埃希菌和痢疾志贺菌抑菌作用显著.康肽宝与抗生素混合使用能显著增强抗生素对金黄色葡萄球菌和猪大肠埃希菌的抑菌活性,对副溶血弧菌、鸡大肠埃希菌、嗜水气单胞菌和猪沙门菌的抑菌活性也有明显的增强作用,但对其他几种测试菌效果影响不明显.试验结果表明,康肽宝也许可以辅助抗生素控制特定病原菌引起的疾病,这也为饲料中减少甚至代替抗生素的使用提供了理论依据.     

禽多杀性巴氏杆菌OmpA DNA疫苗免疫效果的研究

目的:研究禽多杀性巴氏杆菌OmpA DNA疫苗在鸡体内诱导的免疫保护效果。方法:PCR扩增禽多杀性巴氏杆菌的ompa基因片段,克隆入pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pOMPA,体外转染SP2/0细胞,RT-PCR和免疫荧光试验检测目的基因的转录及表达情况。动物免疫共分四组:pOMPA组、弱毒疫苗组、pCDNA3.1(+)空载体组和PBS对照组,每组15只4周龄鸡,除弱毒疫苗组外其他三组均肌注免疫三次,每次间隔两周,弱毒疫苗组仅首免时肌注1羽份/每只鸡。间接ELISA检测免疫后血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫鸡外周血淋巴细胞增殖情况,双抗夹心ELISA检测IFN~γ分泌情况,强毒攻击,计算免疫鸡存活数目及保护率。结果:体外转染检测结果表明pOMPA可在体外培养的细胞中表达目的蛋白。动物免疫后,DNA疫苗组和弱毒疫苗组血清抗体水平持续上升,与两对照组相比差异极显著(P<0.01),且弱毒疫苗组血清抗体水平明显高于DNA疫苗组(P<0.05)。经提取的外膜蛋白(Omps)诱生后,两疫苗组的SI值极显著高于pCDNA3.1(+)组和PBS免疫组(P<0.01),两疫苗组之间则无差别。两疫苗组免疫鸡外周血淋巴细胞产生的IFNγ-极显著高于两对照组(P<0.01)。强毒攻击后DNA疫苗组和弱毒疫苗组的保护率分别为60%和73.3%。结论:成功构建了禽多杀性巴氏杆菌OmpA DNA疫苗,该疫苗为动物提供一定的免疫保护力,但不够理想。     

preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达

目的研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)的跨膜特性。方法依据乙肝病毒大外膜蛋白的计算机模拟图将其分为分别命名为HBsAg1(1-174),HBsAg2(1-245),HBsAg3(1-294),HBsAg4(1-341),HBsAg5(1-373),HBsAg6(1-400),最终累加成一条连续的长链状态,贯穿在细胞内外形成四次跨膜区,并以此6个片段为模板设计6对引物。从含有乙肝病毒外膜蛋白基因的质粒pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg中扩增出前S1,S2基因,采用重叠延伸PCR方法连接人尿激酶原信号肽+6×组氨酸(His)+前S1蛋白、前S2蛋白+HBsAg(1～6)+血细胞凝集素(HA);PCR产物经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入经同样处理的真核表达载体pIRES2-EGFP,构建含有Pro-UK,6×His,preS1,preS2,HBsAg跨膜序列及HA的表达载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA,该表达载体应能够共表达乙肝病毒外膜蛋白和绿色荧光蛋白。采用阳离子脂质体法将构建好的表达载体转染293细胞,经G418加压筛选阳性克隆,并进一步通过荧光观察、蛋白质免疫印迹、免疫双标等方法检测目的蛋白在293细胞的表达。结果 PCR结果显示,电泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600,810,957,1098,1194和1275 bp理论值。酶切鉴定正确的重组质粒测序结果与预期序列完全一致。转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1～HBsAg6的293细胞,呈亮绿色,细胞形态良好,荧光表达强度高;Western印迹结果显示,在相对分子质量31 000,34 000,44 000,47000,54 000和60 000处有明显的阶梯状蛋白信号,条带清晰并与理论值相一致。结论成功构建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表达载体,并获得了能共表达乙肝外膜蛋白跨膜序列和绿色荧光蛋白的293细胞系。     

兔多杀性巴氏杆菌PCR检测方法建立及优化

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,PM)是一种重要的畜、禽、野生动物及人类共患性病原菌。由该菌引起的兔巴氏杆菌病传播快、病程急、发病率和死亡率高,对养兔业危害非常大^〔1〕,同时也会影响到人类的生命健康和安全。     

鸡γ干扰素与补体C3d 主要片段的串联表达及活性测定

目的:本研究将干扰素和补体C3d主要片段进行串联表达,以研究共同刺激细胞的活性,观察它们的免疫佐剂效应,以期获得一种更高效的免疫佐剂。方法:本实验合成了chIFN-γ、chIFN-γ-C3d基因,利用pET29a(+)构建重组载体,并在大肠杆菌BL21中进行诱导表达。将重组蛋白纯化后进行鸡胚内抗新城疫病毒活性研究;并与DNA疫苗共同免疫雏鸡,HI法测定抗体水平,MTT法测定淋巴细胞增殖情况,并分析免疫器官指数变化。结果:成功表达纯化了chIFN-γ和chIFN-γ-C3d两个蛋白,SDS-PAGE电泳检测分子量分别约为17 kD和21 kD,His标签抗体检测表明蛋白表达正确。鸡胚内抗病毒活性测定表明一定浓度的chIFN-γ和chIFN-γ-C3d均可以抑制新城疫病毒的增殖,低浓度时chIFN-γ-C3d抗病毒活性高于chIFN-γ;与DNA疫苗联合免疫后,HA组、γ+HA和γ+C+HA组抗体水平持续升高,且与HA组相比,γ+C+HA组抗体水平更高,差异有极显著统计学意义(P0.01)。第7周开始γ+C+HA组的抗体水平均高于γ+HA组,差异有极显著统计学意义(P0.01)。HA、γ+HA和γ+c+HA组淋巴细胞均显示出较高的增殖活性,且γ+c-HA组增殖活性更高,与HA组差异有极显著统计学意义(P0.01),与γ+HA相比差异有显著统计学意义(P0.05),说明chIFN-γ-C3d、chIFN-γ都具有促进淋巴细胞增殖的作用,并且chIFN-γ-C3d比chIFN-γ作用更强,差异有显著统计学意义(P0.05)。第9周时,γ+C+HA组胸腺指数和法氏囊指数都高于其他组,与γ+HA组相比差异有极显著统计学意义(P0.01)。结论:实验表明,相比于单独的DNA疫苗,chIFN-γ-C3d或chIFN-γ与DNA疫苗联合免疫具有更强的免疫效果,chIFN-γ-C3d比单独的chIFN-γ效果更好,可作为一种新的免疫佐剂应用于DNA疫苗的免疫。