基于上转化发光免疫层析技术建立发热伴血小板减少综合征病毒总抗体快速检测方法

目的基于上转化发光(UPT)免疫层析技术,建立发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)总抗体的现场快速检测方法。方法将SFTSV重组NP蛋白与上转化发光颗粒(UCP)偶联,制备UCP-NP免疫层析试纸条,评价该试纸条检测SFTSV总抗体的灵敏性、特异性和稳定性,并检测SFTSV血清254份,与酶联免疫法(ELISA)比较。结果该方法可在15min内完成SFTSV总抗体检测,可检测1∶500稀释度的SFTSV阳性血清,与其他出血热病毒无交叉反应,加样14d内稳定性较高。UPT免疫层析法与ELISA法检测临床血清样品一致性极高(Kappa=0.967),约登指数为0.973。结论建立了基于UPT免疫层析技术的SFTSV总抗体快速检测方法,该方法灵敏、特异,且操作简便、快速,结果稳定,适合在基层门诊和体检现场推广。     

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒非结构蛋白NSs的原核表达及初步鉴定

目的克隆、表达发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)非结构蛋白NSs,对其功能初步鉴定。方法采用PCR法扩增经密码子优化后的SFTSV NSs基因,并克隆至PGEX-4T-2载体中,构建原核表达载体PGEX-4T-2-NSs,经酶切、测序鉴定后转化表达菌BL21(DE3),再经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶(GST)-NSs融合蛋白,用Western Blot验证融合蛋白GST-NSs的抗原性。结果成功构建了GST-NSs融合蛋白原核表达载体,并在BL21细菌中获得高效表达;纯化后的融合蛋白具有良好的抗原性。结论实现了SFTSV重组NSs蛋白的原核高效表达,为进一步深入研究其结构与功能奠定了基础。     

甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体的构建与表达

目的:构建甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏首例甲型H1N1流感病毒毒株(A/Nan jing/1/2009(H1N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-NS1质粒,双酶切pMD18-T-NS1与PXJ40-HA后,构建真核表达载体PXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。West-ern blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功克隆NS1全长基因,并构建了其真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究提供了材料。     

EHEC O157:H7志贺毒素Ⅱ型A、B亚单位的表达及功能鉴定

目的 克隆、表达肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7志贺毒素(Shiga toxin,Stx)Ⅱ型A、B亚单位,并鉴定其免疫学功能.方法 从EHECO157:H7基因组中克隆编码Stx Ⅱ型A、B亚单位的基因,经测序、酶切后,导入表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌Topl0F',经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)-A和GST-B融合蛋白.分别用A、B亚单位融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得高免血清,观察A、B亚单位血清对小鼠进行毒素攻击的保护作用.结果 Stx Ⅱ型A、B亚单位的GST融合蛋白获得高效表达并纯化;A、B亚单位的高免血清可以保护小鼠对致死量毒素的攻击.结论 Stx Ⅱ型A、B亚单位蛋白可以作为EHEC O157:H7疫苗的候选分子,同时针对A、B亚单位蛋白的中和单抗可以对易感人群起到紧急保护作用.     

严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)人源性单链抗体文库的构建

目的构建人源性严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)单链抗体(scFv)文库,并用SFTSV颗粒对文库进行初步筛选。方法提取8例SFTS恢复期患者外周血淋巴细胞的总RNA,逆转录为cDNA;并以此为模板PCR扩增人源抗体轻链库(Vκ和Vλ)和重链库(VH),再经过重叠PCR随机拼接成scFv基因文库,最后克隆入噬菌粒载体pComb3XSS中,将重组噬菌粒电转化感受态XL1-Blue细胞,得到SFTSV抗体文库,检测文库库容及多样性,并用SFTSV颗粒作抗原对抗体文库进行初步筛选。结果构建的人源SFTSV抗体文库的库容为2.8×10~7,测序结果表明文库多样性好,经过初步筛选获得21个克隆的人源化scFv,具有与SFTSV颗粒结合的活性。结论成功构建了人源抗SFTSV的scFv文库。     

县级疾控中心实验室绩效考核评价的量化研究

目的通过对疾控中心实验室绩效考核指标的科学量化,建立评价体系,对实验室进行绩效考核,以提高其综合检测服务能力。方法建立适应疾控心实验室绩效管理的评价指标及其计算方法,并应用德尔菲法(Delphi technique),通过专家咨询方式,给出了各项指标的权重,建立了对疾控中心实验室绩效管理的评价体系,并用此体系方法对连云港市4家县级疾控中心实验室的工作实绩进行评估。结果通过科学的绩效考核评定,最终4家县级实验室评价一级绩效考核综合得分为75.4、71.8、59.1、52.9;原子吸收分光光度计的综合得分达75分以上的全市只有2家,良好率为40%,气相色谱仪的综合得分达60分以上只有1家,合格率为20%;实验室安全管理情况总评价良好。结论县级疾控中心实验室综合效能不高,应定期开展实验室绩效管理评价,促进疾控中心实验室管理更加科学化、规范化。     

肠道病毒71型重组VP1蛋白的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71VP1全长基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体pET28a(+),构建表达质粒pET28a(+)/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,利用Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经ELISA和Western Blot,验证EV71VP1的抗原性。结果成功构建pET28a(+)/VP1重组质粒,经大肠杆菌表达、纯化获得分子量约为43kDa的融合蛋白,经ELISA和Western Blot,结果显示该蛋白有良好的抗原性。结论实现了肠道病毒7l型VP1蛋白的原核高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定基础。     

人高尔基体蛋白GP73基因的克隆?表达?单克隆抗体的制备及鉴定

目的:高尔基体蛋白73(Golgi protein 73,GP73)是新近发现的肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要血清学标志物?通过克隆?表达人GP73,制备抗GP73单克隆抗体并鉴定其特性?方法:克隆GP73基因,构建GP73原核表达载体pComb3XSS-GP73,诱导表达,以HisFF Trap亲和层析柱纯化GP73-6×His重组融合蛋白?以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗GP73单克隆抗体?以间接法ELISA检测抗体效价;Western blot鉴定抗体特异性;免疫共沉淀法初步检测肝癌患者血清中GP73表达水平?结果:成功表达并纯化了GP73-6×His重组蛋白;获得5株稳定分泌抗人GP73单克隆抗体杂交瘤细胞株;免疫共沉淀证实抗GP73 单克隆抗体能与肝癌患者血清中GP73蛋白特异性结合,GP73水平在肝癌患者血清中较正常人显著升高?结论:成功制备了抗人GP73单克隆抗体,为后期建立检测人GP73的双抗体夹心ELISA方法打下基础?     

ADAM9基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人源性去整合素金属蛋白酶9(ADAM9)基因真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞).方法:利用包含ADAM9全长编码核酸序列的质粒PCR4-TOPO作为模板,用PCR扩增其核心编码区,将其克隆至PMD18-T Vector中构建PMD18-T-ADAM9质粒,同时双酶切PMD18-T-ADAM9及P...