黏膜免疫与转基因植物口服疫苗的研究

人体的呼吸道、消化道和泌尿生殖系统都覆盖着黏膜 ,许多使人致病、致死的病原体大都可经黏膜侵入人体 ,因此 ,研制口服疫苗具有深远的意义。与注射疫苗相比 ,口服疫苗不仅能诱导黏膜免疫反应 ,也能诱导系统免疫反应 ,且避免了由注射器可能带来的疾病传染。随着基因工程的飞速发展和植物转化技术的完善 ,利用植物生物反应器可生产方便、廉价、有效、不需纯化就可直接口服的疫苗[1,2 ] ,即通过抗原蛋白基因在植物可食部位的表达 ,直接食用后激发人体黏膜免疫系统产生抗体 ,预防疾病。这种新型口服疫苗改变了传统的疫苗生产方式和接种手段 ,大…     

重组人肝细胞生长因子真核表达载体的构建

目的构建重组人肝细胞生长因子(rhHGF)的真核表达载体,为后续毕赤酵母蛋白高效表达提供基础。方法根据酵母表达偏爱密码子合成rhHGFcDNA全长序列,将rhHGF和pGAPZαA质粒双酶切后行连接转化,构建穿梭载体pGAPZαA-rhHGF,并鉴定。结果重组真核表达载体pGAPZA-rhHGF经限制性内切酶分析,与理论值相符,测序结果未见碱基变异。结论成功构建了pGAPZαA-rhHGF真核表达载体,为后续毕赤酵母高效表达rhHGF蛋白提供了可行性。     

口蹄疫病毒多抗原表位基因融合表达产物的抗原性分析

目的:筛选出高抗原性的口蹄疫病毒(FMDV)抗原表位组合体, 为能有效启动细胞免疫、高广谱性的口蹄疫植物疫苗的研究提供研究基础.方法:通过化学方法合成O、 A型口蹄疫病毒的5个T细胞表位基因和2个B细胞表位基因单链, 采用套叠PCR的方法将T或是B细胞表位基因分别融合成融合体T或B, 利用同尾酶的性质将融合体T和B连接成3种不同融合方式的串连体, 即5′-T-B-T-3′、 5′-T-T-B-3′和5′-B-T-T-3′; 利用马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)载体在烟草叶片中表达各串连体基因、融合体T基因、融合体B基因和O型口蹄疫病毒的VP1基因; RT-PCR检测各基因在烟草(N.benthamiana)叶片中的转录水平; 间接ELISA及Western Dotblot 检测表达产物的抗原性.结果:各抗原基因在烟草叶片中成功获得了表达, 表达产物的抗原性因不同的融合方式而呈现差异, 其中以5′-T-B-T-3′的融合方式为最高, 5′-B-T-T-3′次之, 再是5′-T-T-B-3′, 但都高于VP1基因的表达产物, 更高于融合体T或B基因的表达产物.结论:通过融合口蹄疫病毒的多个表位基因有可能找到一种研制有效启动细胞免疫反应广谱抗口蹄疫病毒的基因工程疫苗的方法, 且T、 B细胞表位的不同组合方式对免疫活性很可能存在一定的影响.     

异硫氰酸苄酯的防癌抗癌作用与生物合成研究进展

异硫氰酸酯类(ITCs)是十字花科植物重要的次生代谢产物,具有防癌抗癌作用。极具营养价值的热带水果番木瓜中也含有此类成分——异硫氰酸苄酯(B ITC),且含量较高。本文对BITC在防癌抗癌方面的活性及其作用机制、植物体内的生物合成途径及植物分布方面的国内外研究进展予以综述,为进一步研究开发BITC提供理论依据。     

毕赤氏酵母SMD1168/HuIFNα-2b分泌型表达的研究

利用毕赤氏酵母SMD1168构建huIFNα 2b分泌型高效表达工程菌株 ,以提高huIFNα 2b表达量和生物比活性 ,增强临床治疗效果和降低临床应用的毒性副作用。将克隆修饰的huIFNα 2b基因插入pGAPZα A之GAP启动子下游位点 ,构建成含α factor信号肽的重组表达载体 ,转入毕赤氏酵母 (Pichiapastoris)SMD1168,构建成分泌型表达huIFNα 2b的酵母工程菌株。SDS PAGE分析表明 ,该工程菌株huIFNα 2b表达量占菌体分泌总量的 50 %以上 ,表达量为 10 0～ 12 0 μg ml;MTT法测定纯化样品的生物比活性为 6 69× 10 8IU mg蛋白～ 1 11× 10 9IU mg蛋白 ,并通过柱层析分离纯化了huIFNα 2b ,纯度达 99 7% ,回收率达 15%～ 2 0 % ;Westernblotting分析表明表达的huIFNα 2b具有与天然huIFNα 2b相同的免疫原性     

番木瓜中异硫氰酸苄酯及其前体物质苄基硫代葡萄糖苷的含量分析

目的:建立番木瓜中抗癌活性物质异硫氰酸苄酯及其前体物质苄基硫代葡萄糖苷的含量测定方法,并测定它们在番木瓜各部位中的含量。方法:苄基硫代葡萄糖苷采用HPLC法,以依利特Hypersil BDS-C18(200 mm×4.6 mm,5μm)为分析柱,用含0.1%三氟乙酸的乙腈-水梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1,检测波长214 nm。异硫氰酸苄酯采用GC法,色谱柱为SPB1701石英毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25μm),程序升温,载气为氮气。FID检测器温度280℃,进样口温度250℃。结果:苄基硫代葡萄糖苷在0.91～36.4μg范围内线性关系良好(r=0.9992),异硫氰酸苄酯在0.0174～0.556μg范围内线性关系良好(r=0.9992)。除成熟果肉外,苄基硫代葡萄糖苷在其他部位均能检测到,且以种子中含量最高为4.74 mg·g-1;而异硫氰酸苄酯只在花和种子中检测到,以种子中含量较高为0.605 mg·g-1。结论:所建方法可用于番木瓜中苄基硫代葡萄糖苷和异硫氰酸苄酯的含量测定。     

改造的sTRAIL基因在重组毕赤氏酵母菌中的表达及活性分析

利用甲醇毕赤氏酵母系统对改造的TRAIL基因进行优化表达研究及产物活性分析,确定改造后的基因表达量是否提高。应用电转化技术将4种重组表达载体转化毕赤氏酵母菌GS115,经Zeocin抗生素筛选、PCR检测获得阳性酵母工程菌,采用摇瓶发酵及SDS-PAGE进行高效表达菌株的筛选,经CM-柱层析、Western blot及MTT法对重组蛋白进行初步纯化、抗原活性检测和生物学活性分析,确定了最佳摇瓶发酵条件:培养基最适pH值5.5~6.5,最佳甲醇诱导浓度为1%,最适甲醇诱导周期为96h。筛选到高效表达菌株pPICZα-A-sTRAIL/GS115、pPICZα-A-sTRAILK/GS115、pPICZα-A-sTRAILA/GS115、pPICZα-A-sTRAILAK/GS115,其表达量分别达到67,113.4,98,145mg/L,改造后的TRAIL具有抗原活性和生物学活性。对TRAIL基因的改造可以提高其在甲醇毕赤氏酵母系统中的表达。