藏药吉堪明目方对糖尿病视网膜病变大鼠的影响及机制研究

摘要：目的 研究藏药吉堪明目方对糖尿病视网膜病变大鼠肠道菌群、氧化应激、血管异常新生的影响,探讨吉堪明目方治疗糖尿病视网膜病变可能的作用机制。方法 采用高脂饲料喂养合并腹腔注射链脲佐菌素（STZ）50 mg·kg-1诱导糖尿病视网膜病变大鼠模型,模型大鼠随机分为模型对照组、羟苯磺酸钙组、吉堪明目方低、中、高剂量组,另设空白对照组。进行体重、空腹血糖值的常规监测;并于造模成功3个月后连续给药8周,而后测定血清超氧化物歧化酶（SOD）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管紧张素Ⅱ（ANG Ⅱ）的含量;采用苏木素和伊红染色观察视网膜常规病理改变,消化铺片观察微血管变化;采用免疫荧光法观察血管内皮生长因子（ VEGF）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在视网膜组织中的表达情况 ;采用16S rDNA高通量测序技术分析藏药吉堪明目方对大鼠肠道菌群结构的影响。结果 吉堪明目方可降低模型大鼠体重的下降趋势,对血糖无明显影响,可减轻视网膜病理改变,改善视网膜血管紊乱形态。吉堪明目方中剂量组可显著降低ICAM-1含量（P＜0.05）。吉堪明目方各剂量组可显著降低ANG Ⅱ含量（P＜0.05,P＜0.01）。吉堪明目方各剂量组可显著降低VEGF、HIF-1α含量（P＜0.05,P＜0.01）。吉堪明目方可以有效抑制模型对照组大鼠肠道菌群多样性减少的趋势,以吉堪明目方低剂量组的抑制效果最为显著。与正常对照组相比,模型对照组大鼠肠道菌群在属水平上有显著变化;给药后,糖尿病大鼠的肠道菌群开始恢复正常,其中以吉堪明目方中剂量组对大鼠肠道菌群调节作用最好。主成分分析表明,空白对照组与模型对照组比较存在明显差异,阳性药及各给药组对模型大鼠的总体表现均有明显的回调作用,以吉堪明目方中剂量组、吉堪明目方高剂量组效果最佳。结论 吉堪明目方能够减轻糖尿病视网膜病变程度,对糖尿病大鼠视网膜的保护作用机制可能与抑制新生血管的形成、调节肠道菌群有关。     

大黄酸对小鼠肾脏的毒性机制

目的:观察大黄酸长期给药对小鼠肾脏毒性的影响,探讨其可能的毒性机制,为临床合理用药及进一步研究提供一定依据。方法:昆明种小鼠30只,随机分为空白组和大黄酸低、高剂量组(0.175,0.35 g·kg~(-1)),每组10只,雌雄各半。连续灌胃给药60 d。给药期间,观察记录小鼠的一般情况;停止给药后检测动物血清尿素氮(BUN),肌酐(SCr),丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)等指标。计算肾脏指数并检测肾脏中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG),取肾脏,苏木精-伊红(HE)染色观察肾脏组织形态病理变化,免疫组化法检测肾脏转化生长因子-β_1(TGF-β_1)及半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达。结果:与同性别空白组比较,给药组小鼠BUN和SCr均升高(P0.05,P0.01),大黄酸高剂量组30 d后小鼠体质量下降明显,SOD活力明显降低(P0.05,P0.01),TNF-α含量增多(P0.05),Caspase-3表达明显上升(P0.05),雄性给药组肾脏指数下降明显(P0.05,P0.01),雄性大黄酸高剂量组GSH-Px含量显著下降(P0.05),TGF-β_1表达增强(P0.05)。肾脏组织形态病理变化,大黄酸高剂量组可见肾小管管腔中出现蛋白管型,肾小球和肾间质毛细血管充血,肾小管上皮细胞肿胀和淋巴细胞小灶性增生,且雄性小鼠病变更严重,大黄酸低剂量组以上表现较高剂量组不明显。结论:大黄酸长期大剂量给药对小鼠肾脏存在一定毒性,在0.35 g·kg~(-1)·d~(-1)剂量下毒性作用明显,且雄性机体毒性更加明显。其潜在毒性机制可能为引起谷胱甘肽抗氧化系统失衡,诱发过度氧化,触发炎症反应,激活Caspase-3的表达,进而诱导细胞凋亡。     

基于中效方程的黄芩苷与小檗碱抗炎协同作用研究

黄芩苷和小檗碱分别是清热解毒药黄芩和黄连及其复方口服后主要的入血成分[1],二者体内外实验均表现出良好的抗炎活性[2,3],但联合应用的合理性研究还未见报道。本实验研究黄芩苷和小檗碱联合对经典炎症通路关键节点的影响,评价二者合用相关机制。     

基于中效方程的黄芩苷与汉黄芩苷调控NF-κB信号通路的协同作用

目的:利用中效原理定量分析黄芩苷与汉黄芩苷合用的抗炎协同药效学机理。方法:通过脂多糖(LPS100μg·L~(-1)刺激RAW264.7细胞构建体外炎症细胞模型;实验设置正常组,模型组,穿心莲内酯组(10μmol·L~(-1)),黄芩苷组(2.06,4.13,8.25,16.5,33,66,132μmol·L~(-1)),汉黄芩苷组(2.94,5.88,11.75,23.5,47,94,188μmol·L~(-1))和黄芩苷-汉黄芩苷联合组[(2.06+2.94)(4.13+5.88)(8.25+11.75)(16.5+23.5)(33+47)(66+94)(132+188)μmol·L~(-1)];采用酶联免疫吸附测定(ELISA)分别检测药物干预50 min和4 h后细胞培养上清中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)含量;采用硝酸盐还原酶(Griess)法检测药物干预24 h后细胞培养上清中一氧化氮(NO)的含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测药物干预2,12 h后细胞中磷酸化核转录因子-κB p65(p-NF-κB p65)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的活化水平;绘制作用率/非作用率(fa/fu)与剂量的关系表。结果:与正常组比较,模型组RAW264.7细胞中p-NF-кB p65蛋白和iNOS蛋白表达均明显增加(P0.05,P0.01),细胞因子TNF-α,IL-6和NO的表达均显著增加(P0.01);与模型组比较,各给药组高剂量可抑制p-NF-κB p65蛋白的表达(P0.05),汉黄芩苷组和联合组可浓度依赖性下调iNOS蛋白的表达(P0.01),黄芩苷组无明显差异。各给药组高剂量均可显著抑制NO的生成(P0.05),对IL-6生成无明显抑制作用。汉黄芩苷组和联合组可显著抑制TNF-α的生成(P0.05),黄芩苷组无明显差异;在实验剂量下,fa/fu与剂量关系表显示,联合组p-NF-кB p65活化和IL-6生成的fa/fu小于黄芩苷组和汉黄芩苷组,联合组iNOS,TNF-α和NO生成的fa/fu在高剂量时大于黄芩苷组和汉黄芩苷组。结论:黄芩苷和汉黄芩苷对NF-κB通路中不同靶标作用强度差异较大,汉黄芩苷是二者合用的主体药效物质,二者合用对不同靶点表现为不同程度的协同或拮抗作用。     

芦荟大黄素对小鼠肾毒性的作用机制

目的:研究长期给予不同剂量的芦荟大黄素导致小鼠肾毒性,并探讨其毒性机制。方法:将30只昆明种小鼠随机分为雌雄空白组、雌雄芦荟大黄素低、高剂量组(0.8,1.6 g·kg~(-1))。芦荟大黄素各剂量组连续灌胃给药11周,每日早晚各1次。采用生化试剂盒检测小鼠血清尿素氮(urea nitrogen,BUN),肌酐(creatinine,SCr),超氧化物歧化酶(superoxide dismustase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,肾脏总谷胱甘肽(total glutathione,T-GSH)/氧化性谷胱甘肽试剂盒(oxidized glutathione,GSSG)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukins-6,IL-6)水平;苏木素-伊红(HE)染色检测肾脏病理变化;免疫组化检测肾脏半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine aspartic acid specific protease-3,Caspase-3)和转化生长因子-β_1(transforming growth factor-β_1,TGF-β_1)蛋白表达。结果:与同性别空白组比较,芦荟大黄素高剂量组雌、雄小鼠血清中BUN含量升高(P0.05,P0.01),芦荟大黄素高剂量组雄性小鼠血清中SCr含量升高(P0.05),芦荟大黄素低剂量组肾小管轻度损伤,高剂量肾小管和肾小球中度损伤;与空白组比较,芦荟大黄素高剂量组雌、雄小鼠血清MDA含量升高(P0.05),SOD活性降低(P0.05),芦荟大黄素高剂量组雌雄小鼠肾脏中GSH/GSSG含量降低(P0.05),雄性小鼠Caspase-3蛋白表达增加(P0.05);与空白组比较,芦荟大黄素高剂量组雄性小鼠TNF-α和IL-6含量升高(P0.05),芦荟大黄素低、高剂量组雌雄小鼠肾脏TGF-β_1蛋白表达均增加(P0.05)。结论:芦荟大黄素1.6 g·kg~(-1)给药11周,对小鼠肾脏有毒性作用,其机制与机体氧化应激、细胞凋亡和TGF-β_1蛋白表达有关。