无义密码子介导的mRNA降解机制与疾病

<正>无义密码子介导的mRNA降解(nonsense mediated mRNA decay,NMD)现象的发现,最早源于1979年美国学者Losson和Lacroute在对酵母菌URA3基因的研究中观察到无义密码子突变体在mRNA瞬时合成率并非很低的情况下能够降     

抗早发性无义突变疾病药物研究进展

随着后基因组时代的到来,基因芯片和大规模测序技术的日趋完善,各种遗传疾病的病因学原理逐步被人们所了解,个性化治疗也渐渐进入了人们视野。由于遗传、基因突变(无义突变、移码突变、内含子错误剪切)或者后天性获得的原因,在基因组中正常终止密码子的上游,形成了一个提前     

无义突变的人凝血因子IX小基因稳定细胞株选择性剪接的研究

目的:探讨无义突变的人凝血因子IX小基因稳定细胞株发生选择性剪接的分子机制。方法:将人凝血因子IX小基因(Mini-hF9)及其无义突变体分别转染哺乳动物细胞HeLa,经G418抗性筛选、单克隆化得到稳定细胞株;通过RT-PCR及Western blot分别检测稳定细胞株中Mini-hF9基因mRNA的选择性剪接及蛋白表达情况。结果:成功构建了野生型和无义突变的人凝血因子IX小基因稳定细胞株HeLa-F9-WT、HeLa-F9-M1和HeLa-F9-M2。野生型稳定细胞株HeLa-F9-WT中扩增到正常剪接产物Norm;无义突变稳定细胞株HeLa-F9-M1中扩增到Norm和Alt-S1这两种剪接产物,HeLa-F9-M2中扩增到Norm、Alt-S1和Alt-S2这三种剪接产物。结论:无义突变的凝血因子IX基因可能触发无义相关的选择性剪接(NAS)途径,导致选择性剪接的产生。     

重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株的构建及意义

本研究构建重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株并探讨其意义。将人凝血因子Ⅸ(F9)小基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag3B上;利用PCR定点突变技术得到在小基因121位氨基酸位置含有一个提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的无义突变体;将构建的F9小基因及其无义突变体分别转染人肝癌细胞HepG2,经G418抗性筛选,单克隆化扩大培养,得到稳定细胞株,分别命名为HepG2-WT和HepG2-N。结果显示:通过酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析证明,小基因及其无义突变体表达载体构建成功;通过RT-PCR及基因组PCR均扩增到了大小正确的目的基因片段,证明了含有重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体的稳定细胞株构建成功。结论:本研究成功构建了重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株,该细胞株可用于无义突变导致血友病的治疗药物的筛选和PTC通读药物的筛选等。     

凝血因子Ⅸ无义突变真核表达载体的构建及其在COS-7细胞的表达

本研究以含有fⅨcDNA的pcDNA3．1质粒为模板构建4种包含不同类型无义突变的fⅨ真核表达载体并进行鉴定,实现其在COS一7细胞中的表达。采用以PCR为基础的定点突变法体外构建fⅨ基因无义突变体,并通过DNA序列分析进一步鉴定证实;应用脂质体转化技术将野生型、突变型fⅨ表达载体分别瞬时转染COS-7细胞,采用实时定量PCR鉴定fⅨmRNA在各组的相对表达水平。结果表明,4个突变型质粒除相应位点的无义突变外,未见其它突变,提示无义突变载体构建成功。实时定量PCR鉴定表明,各突变组真核表达载体已成功转染COS-7细胞株并能转录为mRNA。结论：采用以PCR为基础的定点突变法可在体外构建fⅨ真核表达载体,并可在COS-7细胞中表达,其转录过程中不引发mRNA降解,这为进一步研究无义突变引起FIX功能丧失及表达量降低的机制和治疗研究提供了物质基础。     

终止密码子位点及无义突变介导的mRNA降解途径抑制对抗早发性无义突变药物atalruen通读效率的影响

目的探讨终止密码子上下文结构和无义突变介导的m RNA降解途径(NMD)抑制对抗早发性无义突变(PTC)药物atalruen通读效率的影响。方法利用聚合酶链反应(PCR)定点突变的方法构建双荧光哺乳动物表达载体的早发性无义突变体p Ds Red-EGFPmtag-Y596X和p Ds Red-EGFPmtag-Y653X,转染哺乳动物细胞COS7,抗早发性无义突变药物atalruen,结合si RNA-upf1、放线菌酮(CHX)共同作用转染细胞,采用实时荧光定量PCR反应检测突变体上红色荧光蛋白(Ds Red)和绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,测定通读效率。结果PTC突变体p Ds Red-EGFPmtag-Y653X对atalruen的促通读敏感性显著大于p Ds Red-EGFPmtag-Y596X;si RNAupf1和CHX抑制NMD对atalruen的促通读效率没有显著影响。结论 PTC位点的+4位核苷酸对于atalruen的促通读效率十分关键,该位置是胞嘧啶(C)的突变体敏感性要显著大于腺嘌呤(A);atalruen与常见促通读氨基糖苷类药物不同,不能协同NMD途径的抑制来促进早发性无义突变的通读。