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目的 探讨肝素结合细胞因子(Midkine)的表达对乳腺癌细胞的增殖和侵袭的作用.方法 采用慢病毒介导的shRNA干扰技术在乳腺癌细胞中沉默Midkine的表达,及利用慢病毒高表达Midkine基因在正常乳腺表皮细胞中.利用蛋白质印迹(Western blot)法检测shRNA干扰或高表达后的正常乳腺表皮细胞和乳腺癌细胞中Mid-kine蛋白的表达情况.利用流式细胞仪技术、Transwell小室实验、及细胞划痕实验,分析Midkine基因高低表达对正常乳腺表皮细胞和乳腺癌细胞生长、增殖、侵袭及转移的影响.结果 首先观察了不同乳腺癌细胞中Midkine的表达情况.其中Midkine只有在BT549、MDA-MB157和MDA-MB436间充质乳腺癌细胞(Mesenchymal cell)中表达,而正常细胞和上皮细胞乳腺癌细胞(Epithelial cell)中不表达.BT549细胞中两种不同shRNA降低Mdikine蛋白表达的效率分别达到100%和90%.HMLE正常乳腺上皮细胞中Midkine高表达效率非常高.结晶紫染色法检测细胞增殖实验结果显示,Midkine-shRNAs转染组BT549细胞的生长速度较阴性对照组降低(P<0.01).流式细胞仪检测结果显示,Midkine-shRNAs转染组BT549细胞的增殖指数为(36.06±2.12)%和(32.06±3.46)%,明显低于对照组53.06±3.68%.同时观察到EMT标识物B连环蛋白(β-catenin)、N钙粘蛋白(N-cadherin)在Midkine-shRNAs转染组BT549细胞中表达上调.Transwell小室实验显示两个Midkine-shRNA转染组BT549细胞迁移(Migration)细胞数为零和(7±4.4)个高/倍视野,它们的侵袭(Invasion)细胞数为(38±7)和(46±8)个/高倍视野,明显低于对照组的迁移(Migra-tion)细胞数(178±14)个/高倍视野,侵袭(Invasion)细胞数(232±35)个/高倍视野.同时也观察到高表达Midkine正常乳腺上皮细胞表现出间质化(EMT)的表型,EMT标识物E钙粘蛋白(E-cadherin)、连环蛋白(β-catenin)在Midkine高表达HMLE细胞中表达下调的现象.细胞划痕实验显示Midkine高表达HMLE细胞组的迁移距离明显高于对照组.结论 在BT549细胞中降低Midkine的表达,可抑制BT549细胞的迁移和侵袭,同时可明显上调对上皮细胞间质化标志蛋白β-catenin和N-cadherin表达,提示在Midkine高表达的肿瘤患者中,通过抑制其蛋白表达可能抑制肿瘤的转移和侵袭. 相似文献
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背景与目的Y-box结合蛋白(YB1或YBX1)在肿瘤发生和癌症进展中发挥关键作用。然而,YB1是否可以通过调节非编码RNAs来影响肿瘤的恶性转化仍是未知的。本研究旨在探讨YB1与microRNAs之间的关系,并揭示YB1通过miRNAs介导的调控网络影响肿瘤进展的潜在机制。方法通过细胞增殖、伤口愈合和Transwell侵袭实验,研究YB1在肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞中的生物学功能。在HCC细胞系中进行微阵列分析,筛选YB1引起失调的miRNAs。通过实时荧光定量PCR、双荧光素酶报告基因、RNA免疫沉淀和pull-down实验分析YB1对miR-205和miR-200b的调控。通过pull-down实验和免疫共沉淀实验确定了YB1、DGCR8、Dicer、TUT4和TUT1之间的关系。采用免疫荧光染色法检测YB1、DGCR8和Dicer的细胞共定位。通过BALB/c裸鼠尾静脉注射转染了YB1 shRNA或shControl的MHCC97H细胞,检测YB1在体内对肿瘤转移的影响。采用免疫印迹法和免疫组化法检测上皮细胞向间充质转化标志物的表达水平。结果YB1不依赖Snail途径,通过调控miR-205/200b-ZEB1轴促进HCC细胞迁移和肿瘤转移。YB1与微处理器DGCR8和Dicer以及通过保守序列CSD(code shock domain)与尿苷酸末端转移酶TUT4及TUT1发生相互作用,抑制miR-205和miR-200b生物合成。随后,下调的miR-205和miR-200b增强了ZEB1的表达,从而促进细胞迁移和侵袭。此外,对肝癌细胞和正常肝组织的基因表达数据进行统计分析,发现YB1表达与ZEB1表达呈正相关,与临床预后显著相关。结论本研究揭示了YB1通过调节肝癌细胞中miR-205/200b-ZEB1轴促进肿瘤进展的新机制。研究结果还表明,YB1可能通过miRNAs介导的基因调控来发挥其生物学功能,可作为治疗癌症的潜在靶点。 相似文献
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