鲢鱼小清蛋白的分离纯化及其单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗鲢鱼主要过敏原小清蛋白的单克隆抗体,并对其基本特性进行鉴定。方法:采用硫酸铵盐析、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等方法纯化鲢鱼小清蛋白;以纯化的小清蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体;通过ELISA法确定抗体亚型;通过腹水诱生法大量制备单克隆抗体;以Protein G Sepharose亲和层析柱纯化制备的单克隆抗体;运用Western blot鉴定单克隆抗体的特异性;以ELISA法分析单克隆抗体的结合位点。结果:从100 g鲢鱼肌肉中可获得约30 mg高纯度小清蛋白;SDS-PAGE结果表明,得到的抗小清蛋白单克隆抗体(A4-C1)纯度较高,亚类为IgG1;Western blot结果显示,A4-C1只与鱼肉粗提物中的小清蛋白产生反应,特异性良好;ELISA分析表明,制备的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体与商品化抗蛙小清蛋白单克隆抗体(PARV-19)的结合位点可能具有很大部分的重叠,或者存在较大的空间位阻效应。结论:研究中制备的杂交瘤细胞株能稳定分泌高特异性的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体,可用于后续淡水鱼类小清蛋白检测方法的建立。     

甲壳类动物4种过敏原的序列分析、抗原表位预测及三维结构建模

目的探明甲壳类动物各种过敏原之间是否存在相似性,以期深入研究甲壳类食品过敏原的构效关系。方法应用生物信息学方法,分析预测了甲壳类动物的4种过敏原—原肌球蛋白(TM)、精氨酸激酶(AK)、肌球蛋白轻链(MLC)和肌质钙结合蛋白(SCP)的二级结构、亲水性、可塑性、抗原性、表面可及性、线性抗原表位和三维结构等。结果 TM为超螺旋结构,而AK、MLC和SCP均为复合蛋白,含有较多的Turn和Coil结构;TM、AK、MLC和SCP 4种过敏原的亲水性区域均在60%以上,可塑性区域约为50%,抗原性区域均在60%以上。TM、AK、MLC和SCP分别有11、10、4和4个线性抗原表位。TM、AK、MLC和SCP的三维结构建模结果与相应的二级结构预测结果一致,基本能够反映此4种过敏原的空间构象。结论通过生物信息学方法分析,同时获得了甲壳类动物4种过敏原TM、AK、MLC和SCP的分子特征、抗原表位及部分三维结构,可望为进一步采用实验方法研究其构效关系奠定理论基础。     

锯缘青蟹原肌球蛋白的过敏动物模型研究

目的建立锯缘青蟹(Scylla serrata)原肌球蛋白(tropomyosin,TM)的食物过敏性小鼠模型,并对其致敏性进行评价。方法锯缘青蟹TM以灌胃方式刺激小鼠使其致敏,并对小鼠粪便组胺、血清IgE以及脾脏细胞IL-4、IL-13、IFN-λ等淋巴因子的水平进行检测。结果 TM组小鼠均出现了不同程度的过敏症状,其血清IgE的含量是阴性对照组(生理盐水)小鼠的2倍;TM组实验小鼠IL-4、IL-13、IFN-λ的水平分别为(17.508±2.189)pg/ml、(3.150±0.434)pg/ml、(15.056±1.974)pg/ml,粪便中组胺含量为6 244.651 nmol/l,与阴性对照组小鼠相比均有显著差异(P<0.05)。结论锯缘青蟹TM以灌胃方式刺激小鼠,TM组小鼠出现了不同程度的过敏症状,其粪便组胺、血清IgE以及脾脏细胞IL-4、IL-13、IFN-λ等淋巴因子的水平与阴性对照组小鼠相比均有显著差异(P<0.05),建立的TM过敏动物模型可望为蟹类过敏的诊断和免疫治疗提供技术依据。     

单克隆抗体的制备及鸡白细胞介素2的纯化

通过将鸡白细胞介素2(ChIL-2)基因克隆至表达载体pQE30，此蛋白在大肠杆菌中得到表达并被纯化。用纯化ChIL-2作为抗原免疫BALB/C鼠，得到了抗ChIL-2单克隆抗体。以单克隆抗体制备免疫亲和层析柱，作者首次从植物血凝素刺激的鸡淋巴细胞上清液中高度纯化了鸡白细胞介素2天然蛋白。纯化蛋白在SDS-PAGE上呈现分子质量分别为16ku和14ku的两条带，提示鸡白细胞介素2可能为糖基化蛋白。     

鱼类主要过敏原小清蛋白的检测

目的:鱼类是主要的致敏食物之一。痕量的过敏原即可能导致过敏患者产生严重的过敏反应,因此,本研究拟对多种鱼类主要过敏原小清蛋白的存在情况进行分析及相对定量检测。方法:采用热抽提获得鱼肌肉中小清蛋白的粗提物,通过Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析粗提物中蛋白的存在情况,利用ELISA法对不同鱼类白肉和红肉中的小清蛋白含量进行测定。结果:Tricine-SDS-PAGE和Western blot结果显示粗提物蛋白主要为小清蛋白,分子量在10～14kD并具有一定的种属特异性。在不同的鱼类中存在着不同数量的小清蛋白异构体,它们与抗蛙小清蛋白单克隆抗体PARV-19的反应程度存在差异,表明小清蛋白的含量有所不同,与PARV-19结合的表位也可能存在一定的差异。ELISA结果显示,不同鱼类白肉中小清蛋白的含量为红肉中的4～33倍。结论:本研究建立的方法可用于多种经济鱼类主要过敏原小清蛋白的有效检测。