链霉菌RNA聚合酶的异质性和启动子的多样性

链霉菌是革兰阳性好氧土壤细菌,其生活周期涉及到一个复杂的形态分化过程,包括孢子发芽、营养菌丝生成、气生菌丝形成和孢子生长.链霉菌的基因组大约为8×10~6~1×10~7个碱基对,相当于大肠杆菌的2倍多,其DNA含有异常高的GC比(约为73%),并有证据表明,染色体的线性形式在链霉菌中很普遍.在链霉菌中,从形态分化到次级代谢过程无不为一个复杂的、常常是相互偶联的多层次调控系统所支配.这些调控层次包括:启动子和RNA鄹合酶的多样性,阻遏作用,活化作用,感受器/响应器调控系统,ppGpp系统,调控tRNA系统,以及被誉为细菌激素的丁羧内酯类化合物系统.许多异源基因,包括人的白细胞介素2(IL-2),牛的生长激素,大肠杆菌木糖异构酶基因等,都可在链霉菌中获得表达.高活性启动子的存在往往是外源基因表达的关键.因而,了解有关链霉菌启动子结构与基因表达的关系,对于构建链霉菌分泌表达载体相当重要.     

苏氨酸操纵子的克隆表达及天冬氨酸激酶的测活

依据途径工程的基本原理，为构建大肠杆菌苏氨酸高产菌林，需强化表达苏氨酸生物合成途径中的关键基因。以Ecoli MC4100染色体DNA为模板，用PCR扩增了天冬氨酸激酶基因thrA部分片段，以之为探针从基因文库中克隆得到thr操纵子，包括启动子、结构基因(thrA、thrB、thrC)、终止子。将结构基因装载于pET-lla质粒上的17启动子下游，得到了表达质粒pTHlla-08。转化E.coli BL21(DE)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，获得了高效的表达。含表达质粒的菌体胞内粗提液经酶活分析表明，天冬氨酸激酶的活性为含载体质粒pET-lla的对照菌的100倍。     

产黄青霉penDE基因的克隆及其在带小棒链霉菌中的表达

penDE基因编码40k的酰基-CoA：6-APA酰基转移酶（IAT），可催化产黄青霉中青霉素生物合成途径的最后一步酶反应。利用RT-PCR法从产黄青霉中扩增得1．1kbp的不含内含子的penDE基因，并将其克隆至大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pUWL201，使PenDE基因位于ermEp启动子的下游，再将其转化带小棒链霉菌，获得了能够表达IAT的转化子。PDAB法和抗菌活性测定表明，所表达的IAT蛋白对6-氨基青霉烷酸和苯乙酰COA有明显的活性。     

荚膜红细菌十聚异戊二烯焦磷酸合成酶异源表达及纯化的研究

 目的构建生产辅酶Q₁₀的大肠杆菌基因工程菌并研究相关酶的表达情况。方法将荚膜红细菌(Rhodobacter capsula-tus B10)中十聚异戊二烯焦磷酸合成酶编码基因ddsA分别克隆在Lac,T7和Trc启动子下游,使其在Escherichia coli JM83中表达。同时利用His-tag的表达系统,对该酶的融合表达和镍柱纯化条件进行了研究。结果产物分析发现该基因在E.coli中表达出有活性的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶,并使宿主产生辅酶Q₁₀。同时,28℃培养过夜,该酶以可溶形式存在于上清液中。在150 mmol·L^-1咪唑的洗涤条件下,从镍柱上解离,并可以达到电泳纯。结论大肠杆菌可以表达 Rhodobacter capsula-tus B10 的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶,并合成辅酶Q₁₀。     

链霉菌辅酶Q9生物合成基因sdsA的鉴定

聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因在4个不同种的链霉菌(Streptomyces coelicolor A3(2), Streptomyces maritimus, Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454和Streptomyces sp.Tü4128)中分别被克隆.测序结果显示:4个聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因均编码336个氨基酸的肽链,4条肽链之间的序列有97%的同源性.将4个不同的聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因分别导入大肠杆菌中进行异源表达,有辅酶Q9产生.将4个基因分别导入八聚异戊二烯焦磷酸合成酶(IspB)缺陷的大肠杆菌KO229(ΔispB)中证明它们有替代ispB基因的功能,并且在大肠杆菌中合成辅酶Q9.     

高活力人降钙素类似物vhCT的免疫原性研究

本研究用固相多肽合成法合成人降钙素类似物vhCT ,产物纯度达到等电聚焦均一 ,质谱测定分子量精确。生物活性为天然人降钙素的 2 0～ 2 5倍。用放射免疫法测定vhCT能与识别天然人降钙素的抗体起反应 ,产生IgG抗体的免疫原性随偶联的不同载体而有差异。但在BALB/C5 7小鼠体内不引起IgE增高。提示vhCT不产生IgE介导的过敏反应 ,具有药物应用前景。     

大肠杆菌caiAB基因的克隆与表达

从E.coli MC4100菌株的染色体DNA中利用鸟枪法克隆含编码豆甜菜碱还原酶和L－肉碱脱水酶的caiAB基因片段，并经序列分析验证。由重组质粒pZJD-1480亚克隆得到pT7-A以及pT7-B重组表达质粒，后者转入E.coli BL21(DE3)菌株中，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）上分子质量为40ku附近可见明显的表达蛋白带。     

Streptomyces sp.Tü 4128中新型抗生素bagremycins抗性基因bagJ的研究

通过框内敲除鉴定了链霉菌Streptomyces sp.Tü 4128中基因bagJ的功能。HPLC结果表明,敲除基因bagJ导致抗生素生产水平大幅降低;回补菌株恢复了抗生素的生产;过表达菌株大幅提高了抗生素的产量,证明基因bagJ在新型抗生素bagremycins的生物合成中必不可少。抑菌圈实验表明基因bagJ敲除菌株较野生菌株对bagremycins更加敏感;BagJ在Streptomyces lividans TK64中异源表达后使该菌株对bagremycins的耐受性增强,证明bagJ是新型抗生素bagremycins的抗性基因。扫描电镜的结果证明了BagJ异源表达后导致Streptomyces TK64的菌丝形态发生了改变。其他抗生素的敏感性实验表明,BagJ可能是一个逆向转运蛋白。     

造血干细胞(CD34+)表达谱数据分析

造血干细胞分化的潜能及自我更新的分子机制是造血干细胞研究中最重要的领域.通过对来自造血干细胞(CD34+)的EST(Expressed Sequence Tags)和SAGE(Serial Analysis of GeneExpression)数据进行系统生物信息学分析,发现了造血干细胞除表达大量下游分化细胞的分子标志外,还表达一些非造血组织的特异基因.在分子调控方面,反义RNA可能是一种非常重要的调控手段.     

荚膜红细菌十聚异戊二烯焦磷酸合成酶异源表达及纯化的研究

目的 构建生产辅酶Q10的大肠杆菌基因工程菌并研究相关酶的表达情况.方法 将荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus B10)中十聚异戊二烯焦磷酸合成酶编码基因ddsA分别克隆在Lac,T7和Trc启动子下游,使其在Escherichia coli JM83中表达.同时利用His-tag的表达系统,对该酶的融合表达和镍柱纯化条件进行了研究.结果 产物分析发现该基因在E.coli中表达出有活性的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶,并使宿主产生辅酶Q10.同时,28℃培养过夜,该酶以可溶形式存在于上清液中.在150 mmol·L-1咪唑的洗涤条件下,从镍柱上解离,并可以达到电泳纯.结论 大肠杆菌可以表达Rhodobacter capsulatus B10的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶,并合成辅酶Q10.