pp32表达引起人肝癌细胞HepG2形态改变

目的:研究pp32在肝癌细胞中的作用.方法:采用RT-PCR的方法钓取pp32全长基因.脂质体介导的方法将pp32基因导入HepG2细胞.观察细胞形态,血清依赖性和接触抑制等细胞表型,测量细胞生长曲线,检测ALP、LDH、γ- GT、ALB和AFP等生化指标.结果:成功钓取了pp32全长基因,筛选获得pp32稳定表达的HepG2细胞株.pp32表达使HepG2细胞伸出细长突起,但不影响HepG2细胞增殖.ALP和LDH酶活力升高,其他指标没有变化.结论:pp32表达引起人肝癌细胞HepG2形态改变,但不改变其恶性表型.     

干细胞临床应用安全性评估报告

目的通过对现阶段干细胞治疗技术的安全状况进行系统评价,为各层次决策者包括卫生行政部门和患者等提供合理选择干细胞治疗技术的科学信息和决策依据。
　　方法采用卫生技术评估方法对造血干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞和诱导多能干细胞在临床研究和应用中的死亡率,伤残率,不良反应的发生率、持续时间以及严重程度等方面进行系统评估。
　　结果造血干细胞移植最常用于治疗血液系统的恶性肿瘤,这一类别研究报告的不良反应较多,多数与合并使用的放化疗和移植前的预处理有关;异体造血干细胞移植易出现急慢性移植物抗宿主病（GVHD）,严重影响患者的预后。自体造血干细胞移植还常用于肿瘤或自身免疫性疾病放化疗后的支持,此时虽然仍会出现一些放化疗的不良反应,但不会出现 GVHD。自体造血干细胞移植尝试治疗一些肝脏和缺血性疾病等,不良反应报道相对较少。②无论是自体还是异体来源的间充质干细胞移植,在临床试验中未见明显的毒性反应和致瘤性报道,无 GVHD 报告。临床上见到的不良反应多数较轻微,短暂发热和注射部位局部疼痛偶有报道,有些不良反应与注射途径和部位有关。③胚胎干细胞移植的动物实验均表明有畸胎瘤的形成,尚未有关于直接用胚胎干细胞进行临床研究的报道。④神经干细胞移植多见于治疗神经系统疾病,未发现严重不良反应,无致瘤性报道。⑤脂肪干细胞移植治疗肛周瘘,未发现严重不良反应,无致瘤性报道。⑥诱导多能干细胞研究目前多数仍为方法的研究,无临床文献报道。动物实验表明诱导多能干细胞移植后其后代会发生肿瘤,同时诱导过程中反转录病毒的使用对安全性的影响仍需研究。
　　结论造血干细胞移植开展最早、研究最为深入和广泛,间充质干细胞是继造血干细胞之后临床应用研究最多的一类干细胞,神经干细胞和脂肪干细胞目前也进入临床试验阶段,胚胎干细胞和诱导多能干细胞因其致瘤性等安全问题,目前还在临床前研究阶段,临床试验报到很少。从目前文献看,自体造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞等成体干细胞移植,相对来说比较安全。由于目前多数干细胞的临床研究尚处于试验阶段,病例数不多,特别是干细胞不似普通药品或生物制品,各项研究采用的制备方法、质量控制不尽相同,一项研究的数据不一定能全面反应所有同类干细胞的安全性,因此,干细胞的安全性需要随着干细胞的研究进展不断加以总结和完善。     

肝刺激物促肝细胞增殖信号转导途径的初步研究

目的：探讨新生牛肝肝刺激物(hepatic stimulator substance，HSS)促进SMMC7721肝癌细胞增殖的信号转导途径。方法：对新生牛肝进行多步分离，采用^3H-Td RDNA掺入法检测分离物的促增殖活性，从而获得具增殖刺激活性的HSS；Western印迹方法检测其对肝癌细胞MAPK Thr202／Tyr204的磷酸化作用并检测其对SPK的激活作用。结果：经多步分离纯化，获得了活性较高的HSS粗提物，Western印迹法结果显示HSS粗提物能明显提高MAPK的磷酸化水平，并能激活细胞内的SPK活性。结论：HSS对细胞的增殖刺激可能是通过SPK和MAPK途径发挥作用。     

肝特异性生物活性肽研究进展

肝脏是人体内最重要的器官之一,具有强大的再生能力。肝再生的调控机制非常复杂,众多因子参与其中,但大多数因子,类似肝细胞生长因子（HGF）、表皮生长因子（EGF）都不具备肝细胞作用的特异性。近年来,本实验室从新生小牛的肝脏中分离得到了能够特异性地促进肝细胞增殖、促进70%肝切除小鼠肝再生的物质并将其命名为HPPCn。因此,结合本实验室的工作对肝刺激物（HSS）、肝再生增强因子（ALR）、HPS、HPPCn等具有肝特异性作用的生物活性肽的研究进展以及相互之间的异同加以综述。     

肝细胞生成素Cn促进肝干／祖细胞增殖的功能研究

目的：检测肝细胞刺激因子肝细胞生成素Cn（ hepatopoietin Cn,HPPCn）作用肝祖细胞的功能。方法利用MTT法、AnnexinⅤ和PI荧光染色法分别检测WB-F344细胞增殖及其抗凋亡能力,Transwell法检测细胞迁移能力。建立小鼠2AAF-部分肝切除（partial hepatectomy）模型,分析高表达HPPCn对肝干／祖细胞增殖和迁移的影响。结果重组HPPCn蛋白能促进WB-F344细胞的增殖及细胞迁移,低浓度HPPCn能抑制WB-F344细胞的凋亡,并激活WB-F344细胞中SphK1、Erk1／2以及Stat3信号通路。动物模型检测结果显示,肝特异HPPCn转基因小鼠部分肝切除后,肝卵圆细胞较对照组明显增多,肝再生能力增强。结论 HPPCn能促进肝干／祖细胞增殖和存活,并通过促进肝卵圆细胞增生,提高肝再生能力。     

抑瘤素表达产物诱导大鼠肝干细胞WB-F344体外分化

目的:抑瘤素是一种肝细胞促分化因子,能够诱导胚胎肝细胞分化为具有各种代谢功能的成熟肝脏。构建以抑瘤素为主的肝干细胞体外诱导微环境,观察其诱导大鼠肝脏来源的干细胞WB-F344体外分化。方法:实验于2002-10/2004-07在解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所完成。①实验材料:表达抑瘤素的CHO-OSM-EGFP细胞株由李晓利等构建。WB-F344细胞由姚鹏博士惠赠。②实验方法:将终浓度为20%稳定表达抑瘤素的中国仓鼠卵巢细胞上清中加入浓度为1U/mL胰岛素、1×10-7mol/L地塞米松,与WB-F344细胞共培养。空白对照组中未加入诱导分化成分CHO-OSM-EGFP细胞上清、胰岛素、地塞米松。③实验评估:采用流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡,光学显微镜观察细胞形态,RT-PCR分析白蛋白及甲胎蛋白基因表达。结果:①诱导后的WB-F344细胞较空白对照组G2/M S期细胞所占比例明显减低,增殖指数下降约2.8倍,G0/G1细胞所占比例明显增加。②实验组WB-F344细胞形态发生明显改变,由最初的多角形变为长梭性,细胞伸出小管状伪足,核质比例下调,形态趋于成熟大鼠肝脏实质细胞。③RT-PCR结果显示,诱导后WB-F344细胞表达白蛋白,不表达甲胎蛋白。诱导前WB-F344细胞表达甲胎蛋白,不表达白蛋白。结论:在以抑瘤素为主的诱导微环境中,WB-F344细胞表现出生长抑制,形态及功能趋于成熟的大鼠肝细胞     

新的肝细胞生长因子HPPCn的人多组织表达谱分析

目的观察新型肝细胞生长因子肝细胞生成素Cn（HPPCn）在人不同组织和细胞中的表达谱。方法采用Northen印迹和多组织芯片点杂交的方法,在mRNA水平上观察HPPCn在18种人肝源细胞系和非肝源细胞系中的表达水平,以及60种成人和7种胚胎组织中的分布。结果 HPPCn在脑、心、肝和肾中表达水平较高,而在肺、胸腺、横纹肌、结肠等组织中低表达,成年组织中的表达水平高于胚胎组织。HPPCn在肿瘤细胞中表达水平较高,在4种肝癌细胞系中的转录水平是正常肝细胞系L02的2～4倍。结论 HPPCn呈多细胞、多组织分布,在肝癌细胞中的表达水平高于正常肝细胞。     

定量检测肝细胞生成素Cn的双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的 建立定量检测肝细胞生成素Cn (HPPCn)的双抗体夹心ELISA方法.方法 利用杂交瘤方法获得8个抗HPPCn单克隆抗体(mAb),并行SDS-PAGE和Western印迹对纯化抗体特性进行鉴定.利用镀金芯片法对8个抗体进行配对检测.通过方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体的最适工作浓度.以纯化的HPPCn抗原为标准品建立标准曲线.结果 得到了8株稳定分泌抗人HPPCn抗体的杂交瘤细胞株,分别为Ab 65-29-6,Ab_3-3-3,Ab_9-34-1,Ab_4-8-12,Ab_7-8-10,Ab_2-30-23,Ab_1 1-11-12和Ab_12-27-23.8个抗体均能够特异结合HPPCn抗原,其中Ab_65-29-6与细胞中HPPCn结合的特异性最好.经抗体配对检测证实最佳配对组合为:Ab_2-30-23和Ab_4-8-12.包被抗体Ab_2-30-23和识别抗体Ab 4-8-12的最适工作浓度为2.5 μg/ml,最适稀释度为1∶2000,标准曲线检测的线性范围为5.0～60 ng/ml.结论 制备了可特异性检测人HPPCn蛋白的单克隆抗体,并建立了一种可用于定量检测人HPPCn的双抗体夹心ELISA方法.     

pp32在前列腺癌细胞中的作用研究

目的研究pp32在前列腺癌细胞中的作用。方法将本实验室先前保存的pcDNA3．1和pcDNA3．1一pp32质粒,转染至Pc3M细胞,构建Pc3M—pp32稳定细胞株。吉姆萨染色实验观察Pc3M细胞的形态变化,通过Transwell小室法检测细胞迁移能力。黏附测定实验鉴定细胞的黏附能力,采用MTr法测定细胞生长曲线。最后,Western印迹检测N一钙黏蛋白（N—cadherin）在细胞中的表达。结果成功筛选并获得了稳定过表达pp32的细胞株（Pc3M．pp32）,pp32能引起Pc3M细胞形状的显著改变,引起人前列腺癌细胞Pc3M迁移和黏附能力的增加,明显促进Pc3M细胞的生长,并有效抑制N一钙黏蛋白在Pc3M细胞中的表达。结论过表达pp32可引起Pc3M细胞的形状改变,并可促进Pc3M细胞的迁移、黏附以及生长。